正交设计优选合爽舒颗粒提取工艺

王 刚,蒋永梅,梁俪之,甘天清,周旭美

(遵义医学院 药学院药物化学教研室,贵州 遵义 563099)

合爽舒颗粒由青皮、白芷、皂角刺、泽兰、夏枯草、地龙、金银花、王不留行卷柏9味药组成。全方具有疏肝解郁,行气止痛,活血化淤；软坚散结,消极化痰,健脾益气之功效,用于治疗肝郁气滞型乳腺增生症。该药是一世代相传的中医验方,在民间使用已有90多年历史,现作为汤剂在临床使用,但汤剂不易保存,使用不便,因此拟将汤剂改成颗粒剂。

前期利用大鼠乳腺增生试验对该复方的几种提取方法进行初步药效学比较,结果显示水提和醇提两种方式相结合所得提取液治疗乳腺增生的效果好于单纯水提及单纯醇提的效果。已有研究表明,白芷[1-4]有效成分为欧前胡素,王不留行的有效成分是黄酮类化合物[5-7],它们在乙醇中都有较高溶解度,故白芷等药采用乙醇提取,以欧前胡素的提取量和出膏率为综合评价指标；青皮等药采用水提,其中青皮为君药,其有效成分为橙皮苷[8-10],故水提工艺以橙皮苷的提取量和出膏率为综合评价指标。通过正交试验优选合爽舒颗粒的水提取和乙醇提取工艺,为该颗粒的进一步开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 安杰伦高效液相色谱仪(DAD紫外检测器,G1311A四元高压溶剂输液泵,1100色谱工作站)；超声波清洗器(金华雷琪实验器材有限公司,SB5200)；旋转蒸发仪(玛尼仪器公司,RE-52AA)；电子恒温水浴锅(上海皓庄仪器有限公司)；万分之一电子天平(上海精科公司)。

橙皮苷标准品(成都瑞芬思生物科技公司,批号：150621)；欧前胡素标准品(中国药品生物制品检定所,批号：110827-200407)；甲醇为色谱纯(天津科密欧公司)；其他试剂均为分析纯；全程使用二次蒸馏水(自制)；所有药材购自遵义德仁堂药店,经遵义医学院天然药物协同创新中心杨建文教授鉴定为真品。

1.2 方法

1.2.1 水提工艺条件考察方法

1.2.1.1 橙皮苷含量测定 色谱条件：色谱柱为Ascentis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(40∶60),流速为1.0 mL/min,进样量为20μL,柱温25 ℃,检测波长为283 nm。理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000 (见图1)。

A：标准品；B：供试品；C：阴性对照品；1-：橙皮苷。图1 合爽舒颗粒橙皮苷含量测定HPLC图

标准品溶液的制备：精密称量标准品11.8 mg,加甲醇适量,超声20 min,然后用甲醇定容于25 mL量瓶中,摇匀、即得(每mL中含橙皮苷0.47 mg)。

供试品溶液的制备：取水提液100 mL,浓缩,80 ℃减压干燥,置棕色具塞锥形瓶中,精密加入70 mL甲醇,超声30 min,过滤,用甲醇定容于100 mL量瓶中,摇匀、即得。

阴性对照品溶液：采用除了青皮外的所有药材，参照供试品溶液的制备方法,制成阴性对照品溶液,然后将溶液用0.45 μm滤膜过滤,再用高效液相色谱仪测定峰面积。

标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL,然后准备6个10 mL棕色容量瓶,洗净、吹干,将吸取的标准品溶液分别放置于6个容量瓶中,接着再用甲醇定容,充分摇匀,即得不同浓度的对照品溶液,然后将标准品溶液用0.45 μm滤膜过滤,再用高效液相色谱仪测定峰面积。根据峰面积和橙皮苷浓度,绘制标准曲线,再经SPSS 19.0软件计算得回归方程：A=14 230C+0.046 7,r=0.999 6。结果表明,橙皮苷的浓度在0.047～0.282 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

1.2.1.2 正交设计筛选最佳提取工艺 因素水平的确定：对水提过程中的主要影响因素(加水量、提取次数和提取时间)进行考察,每个因素取3个水平,选用L9(34)正交设计表安排实验,以出膏率和橙皮苷含量为考察指标来确定最佳提取工艺。结果(见表1)。

实验方法与浸膏得率的测定：按处方中各药材的比例,分别称取青皮等药材,每份155 g,共9份,按照因素水平表和L9(34)正交表操作,将每份提取液浓缩,并定容至500 mL备用。出膏率测定：精密吸取400 mL溶液,浓缩,80 ℃减压干燥,测定每份的浸膏重量,计算出膏率。橙皮苷及出膏率最大值为1,橙皮苷按0.5权重,出膏率按0.5权重。

总评分=橙皮苷/橙皮苷最大值×0.5+出膏率/出膏率最大值×0.5。

表1水提工艺条件考察中正交实验因素水平的设计

水平因素加水量(倍)A提取时间(h)B提取次数(次)C1101.012141.523182.03

1.2.2 醇提工艺条件考察方法

1.2.2.1 欧前胡素测定方法 色谱条件：色谱柱为Ascentis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(55∶45)；体积流量1.0 mL/min；检测波长300 nm；柱温为25；理论塔板数按欧前胡素峰计算应不低于2 000；在此条件下,供试品中欧前胡素峰与其他峰能达到基线分离(见图2)。

A：标准品；B：供试品；C：阴性对照品；1-：欧前胡素。图2 合爽舒颗粒欧前胡素含量测定HPLC图

标准品溶液的制备：精密称取欧前胡素对照品10.7 mg,加甲醇适量,超声20 min,然后用甲醇定容于25 mL容量瓶中,摇匀、即得,制成0.428 mg /mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取醇提液100 mL,浓缩,80℃减压干燥,置棕色具塞锥形瓶中,精密加入20 mL甲醇,超声30 min,过滤,用甲醇定容于25 mL量瓶中,摇匀、即得。

阴性对照品溶液：采用除了白芷外的所有药材，参照供试品溶液的制备方法,制成阴性对照品溶液,然后将溶液用0.45 μm滤膜过滤,再用高效液相色谱仪测定峰面积。

标准曲线的绘制：精密吸取上述欧前胡素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置10 mL量瓶中,甲醇定容,滤过,进样量为10 μL,依法测定。以对照品进样量(mg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归处理,得欧前胡素回归方程为:Y=21 692X-20.806(r=0.999 7) ,表明欧前胡素在0.043～0.258 mg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

1.2.2.2 正交设计筛选最佳提取工艺 因素水平的确定：拟以A乙醇浓度(%)、B乙醇用量(倍)、C提取时间(h)、D提取次数(次)为主要考察因素,选用L9(34)正交表设计试验,以出膏率和欧前胡素含量为考察指标来确定最佳提取工艺(见表2)。

表2醇提工艺条件考察中正交实验因素水平的设计

水平因素含乙醇浓度(%)A乙醇用量(倍)B提取时间(h)C提取次数(次)D13081.01250101.52370122.03

实验方法与浸膏得率的测定 实验方法：按处方中各药材的比例,分别称白芷等药材,每份30 g,共9份,按照因素水平表和L9(34)正交表操作,将每份提取液浓缩,并定容至500 mL备用。出膏率测定：精密吸取400 mL溶液,浓缩,80 ℃减压干燥,测定每份的浸膏重量,计算出膏率。欧前胡素及出膏率最大值为1,欧前胡素按0.7权重,出膏率按0.3权重。

总评分=欧前胡素/欧前胡素最大值×0.7+出膏率/出膏率最大值×0.3。

2 结果

2.1 水提工艺条件考察

2.1.1 橙皮苷含量测定 精密度试验：用移液管吸取同一个供试品溶液,然后将溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,连续进样6次,计算峰面积的RSD为0.76%,表明方法精密度良好。

稳定性试验：用移液管吸取同一个供试品溶液于5个容量瓶中,在室温下分别静置0、2、4、8、12 h,然后将5份溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,计算峰面积的RSD为1.25%,供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：用移液管吸取同一批供试品溶液(批号：130901)6 份,然后将6份溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,计算峰面积的RSD为1.91%,表明方法重现性良好。

加样回收率试验：精密量取同一批提取液(批号：130911,橙皮苷浓度为96.25 mg/L)5 mL,共9份,等分为3组,精密量取橙皮苷标准品溶液(浓度为473.56 mg/L)0.8、1.0、1.2 mL,分别加入3组提取液中,按“1.2.1.1”制成供试品溶液,测定橙皮苷峰面积,计算橙皮苷平均回收率为100.43%,RSD为2.96%。试验结果表明方法回收率较好(见表3)。

表3橙皮苷加样回收率实验

样品含量(mg)加入量(mg)测定量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.4810.3790.85197.560.4810.3790.85799.240.4810.3790.85197.590.4810.4730.962101.620.4810.4730.977104.78100.432.960.4810.4730.976104.610.4810.5681.061102.190.4810.5681.03497.330.4810.5681.04398.95

2.1.2 正交试验 实验结果及方差分析:根据正交试验结果及方差分析(见表4和表5)得出,C因素(提取次数)和A因素(加水量)对试验结果的影响具有统计学意义(P<0.05),B因素(提取时间)对试验结果的影响不具有统计学意义(P>0.05)。根据试验结果确定最佳工艺为A3B2C3,即加水18倍量,提取3次,每次1.5 h。

最佳工艺验证试验：按优选的工艺条件提取制备3批样品,结果水提工艺中橙皮苷提取量分别为3.12、3.18、3.14 mg/g；出膏率分别为37.23%、37.56%、37.14%。说明优选的工艺条件稳定可行。

表4橙皮苷正交试验设计表及结果

试验号ABCD橙皮苷提取量(mg/g)出膏率(%)评分111110.9420.230.44212221.9729.860.76313332.3034.510.89421232.1324.510.72522312.7632.460.94623121.6525.190.64731322.5236.640.95832132.2324.530.74933212.4434.550.91K12.092.111.822.28K22.302.472.392.37K32.602.442.782.34R0.510.360.960.09

表5橙皮苷方程分析

变异来源S自由度均方FPA0.04420.022022<0.05B0.02420.00121.2>0.05C0.15520.077577.5<0.05D(误差)0.00220.00101.0

F0.05(2,2) =19.0。

2.2 醇提工艺条件考察

2.2.1 橙皮苷含量测定 精密度试验：用移液管吸取同一个供试品溶液,然后将溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,连续进样6次,计算峰面积的RSD为1.17%,表明方法精密度良好。

稳定性试验：用移液管吸取同一个供试品溶液于5个容量瓶中,在室温下分别静置0、2、4、8、12 h,然后将5份溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,计算峰面积的RSD为0.87%,供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：用移液管吸取同一批供试品溶液(批号：130901)6 份,然后将6份溶液用0.45 μm滤膜过滤,按前面所述的高效液相色谱条件测定峰面积,计算峰面积的RSD为1.29%,表明方法重现性良好。

加样回收率试验：精密量取同一批提取液(批号：130918,欧前胡素的浓度为89.04 mg/L)5 mL,共9份,等分为3组,精密量取欧前胡素标准品溶液(浓度为428.11 mg/L)1.0、1.2、1.4 mL,分别加入这3组提取液中,按“1.2.2.1”制成供试品溶液,测定欧前胡素峰面积,计算欧前胡素平均回收率分别为99.77%,RSD为2.44%。试验结果表明方法回收率较好(见表6)。

表6欧前胡素加样回收率实验

样品含量(mg)加入量(mg)测定量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.4450.4280.880101.640.4450.4280.887103.170.4450.4280.885102.900.4450.5140.95398.790.4450.5140.94597.3599.772.440.4450.5140.94797.590.4450.5991.03298.020.4450.5991.02897.280.4450.5991.051101.19

2.2.2 正交试验 实验结果及方差分析：根据正交试验结果及方差分析(见表7和表8)得出,A因素(乙醇浓度)对试验结果的影响具有统计学意义(P<0.05),其它因素对试验结果的影响依次是C因素(提取时间)、D因素(提取次数)和B因素(乙醇用量),对试验结果的影响均不具有统计学意义(P>0.05)。根据试验结果确定最佳工艺为A3B1C2D3,即70%乙醇8倍量,提取3次,每次1.5 h。

最佳工艺验证试验：按优选的工艺条件提取制备3批样品,结果醇提工艺中欧前胡素提取量分别为0.81、0.85、0.86 mg/g；出膏率分别为20.78%、21.16%、20.94%。说明优选的工艺条件稳定可行。

表7欧前胡素正交试验设计表及结果

试验号ABCD欧前胡素提取量(mg/g)出膏率(%)评分111110.1714.710.35212220.4217.350.62313330.1514.940.33421230.6918.820.90522310.2620.130.50623120.4819.570.71731320.7024.360.98832130.6517.220.84933210.7218.510.93K11.292.221.921.29K22.101.952.462.10K32.761.951.802.76R0.490.090.220.18

表8欧前胡素方差分析

变异来源S自由度均方FPA0.35720.178523.80<0.05B(误差)0.01520.00121.00>0.05C0.07920.03955.27>0.05D0.04720.02353.13>0.05

F0.05(2,2) =19。

3 讨论

乳腺增生是女性最常见的乳房疾病,其发病率占乳腺疾病的首位[11-12]。近些年来随生活节奏的加快、社会竞争压力导致该病发病率呈逐年上升趋势,年龄也越来越低龄化,严重影响中青年妇女生理和心理健康。合爽舒颗粒源自经多年临床验证的验方,具有治疗乳腺增生的功效。因此开发合爽舒颗粒具有很大的临床应用价值。

3.1 检测波长的选择 对橙皮苷和欧前胡素的甲醇溶液作紫外扫描,在200～400 nm波长范围内,橙皮苷在283 nm处有较大吸收,欧前胡素在300 nm处有较大吸收。以此为检测波长可获得较高的灵敏度和良好的选择性。

3.2 流动相的选择 橙皮苷含量测定根据2015年版中国药典一部采用的流动相为: 甲醇-水(25∶75),结果发现橙皮苷峰保留时间过长,后将甲醇-水系统比例改为(40∶60),所得色谱图峰形好,能获得很好的分离度,决定采用流动相为:甲醇-水(40∶60)。欧前胡素含量测定根据2015年版中国药典一部采用的流动相为:甲醇-水(55∶45),结果发现欧前胡素峰形较好,具有很好的分离度,故决定采用流动相为:甲醇-水(55∶45)。

3.3 结论 通过正交试验,优选出合爽舒颗粒最佳提取工艺,该工艺稳定、可靠。并通过反向高效液相色谱建立了含量测定方法,重现性好,精密度高,操作简便。

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