龙眼叶提取物治疗痤疮的实验研究

王 旗,任梦婷,石亚男,芶明丽,张凤玲,刘娅芳,魏在荣,王达利,徐尚福

(1.遵义医学院 美容医学系，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 烧伤整形外科， 贵州 遵义 563099;3.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

痤疮常发于青少年，是一种慢性炎症性损容性皮肤病，痤疮发生后常遗留色素沉着，毛孔粗大，甚至形成瘢痕，给患者的容貌及心理带来巨大压力。研究认为淋巴细胞、异物巨细胞浸润构成的慢性炎症过程[1-2]，性激素分泌紊乱和皮脂腺内正常菌群(主要是痤疮丙酸杆菌)的大量繁殖、皮脂腺导管的异常角化，皮脂的大量分泌等都会导致痤疮的发生[3-4]。目前痤疮的治疗方法主要有光疗法、外用药膏、口服中药等。但由于现有的治疗手段价格昂贵、毒副作用大、治疗周期长，加之患者本身的不重视，使痤疮恶化发展为瘢痕，严重影响患者的生活质量给患者带来巨大的精神压力[5]。因此，寻找一种简单、经济、有效的治疗痤疮的药物，具有重要意义。

龙眼叶为无患子科龙眼属植物龙眼(DimocarpuslonganLour.)的叶，以叶入药，主要化学成分有黄酮类、酚类、香豆素类、挥发油、植物甾醇、糖类、苷类、鞣质、有机酸等[6]。龙眼叶提取物具有清除自由基和提高细胞免疫力等药理作用[7]。《全国中草药汇编》记载，龙眼叶可清热解毒，解表利湿[8]，民间亦有龙眼叶水煎治疗痤疮的应用。然而对龙眼叶治疗痤疮的实验研究未见报道。因此，本实验就龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型进行研究，为龙眼叶提取物对痤疮的治疗作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰兔，48只，雌雄各半，购自重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心，体重1.5～2.5 kg，许可证号：SCX K(军)2007-017。

1.2 试剂 痤疮丙酸杆菌从中科院微生物研究所购入，菌号112236；供试品的龙眼叶提取物购自南京泽朗植物提取有限公司；维甲酸乳膏为四川明欣药业有限公司产品；浓齿轮油液为埃克森美孚石油有限公司产品；白介素-1β(IL-1β，批号：AF06298501)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，批号：AF06245761)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB染色试剂盒购自基因科技有限公司，产品货号GK600705，批号：2016090101。兔IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号分别为：20160723、20160725)。

1.3 仪器设备 自动脱水机，为德国Leica公司产品，型号为ASP 300；石蜡包埋机，为德国Lecia 公司产品，型号为EG1160；平推式切片机，为德国Lecia 公司产品，型号为Microm HM400R；病理图像分析系统由日本OLYMPUS显微镜和JVC摄像仪组成，型号分别为BX40 和TK-C1381。

1.4 方法

1.4.1 痤疮丙酸杆菌菌液制备 冻干的痤疮丙酸杆菌在厌氧条件下，以硫乙醇钠培养基増菌后，以生理盐水洗涤3次，调整丙酸杆菌浓度为6×103个/L，95 ℃下水浴灭活15 min。

1.4.2 龙眼叶提取物外用溶液制备 本研究中药物剂量参考龙眼叶民间用药剂量和药典龙眼肉临床推荐使用剂量，按4∶2∶1比例配制龙眼叶提取物成高、中、低浓度。即浓度设定为0.2、0.1、0.05g /mL，局部外用。

1.4.3 分组及给药 新西兰兔48只，雌雄各半，按体重和性别随机分成6组：空白对照组、模型组、龙眼叶提取物(0.05、0.1、0.2 g/mL)组及维甲酸(0.1%)组，每组8只。各组新西兰兔(除空白对照组外)均于左耳内侧面耳管开口处约3 cm×3 cm范围，涂抹浓齿轮油液每天1次，连续35 d。涂抹浓齿轮油后第22天和第29天，在每只兔耳廓皮内注射痤疮丙酸杆菌液1 mL。从第36天开始各实验组新西兰兔开始按设定浓度局部给药，连续2周。给药同时按前述造模方法继续涂抹齿轮油，6 h后局部给药。末次给药后用氨基甲酸乙酯(20%)耳缘静脉注射麻醉新西兰兔，颈总动脉插管取血，空气栓塞法处死后剪取造模处耳组织保存备用。

1.4.4 兔耳痤疮形态学观察 肉眼观察兔耳造模处皮肤的变化(包括：耳厚度、硬度、粗糙程度及黑角栓)，并拍照。剪取的兔耳组织用10 %甲醛溶液固定，对固定后的兔耳组织进行修剪、包埋、切片、苏木素-伊红染色、封片，显微镜下观察兔耳组织表皮层和真皮浅层厚度、细胞形态及排列，有无炎细胞浸润等。

1.4.5 ELISA技术检测兔外周血中IL-1β和TNF-α的含量 外周血950 ×g离心后获得血清。①酶标包被板底部加样品血清50 μL，含梯度标准品及空白对照，轻晃混匀；②封板膜封板后置37 ℃温育30 min；③弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液洗涤，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；④每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外，温育30 min后洗涤；⑤每孔先后加入显色剂A、B各 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min；⑥每孔加入终止液50 μL，终止反应，450 nm波长进行酶标检测。

1.4.6 免疫组化法检测兔耳造模处IL-1β和TNF-α蛋白表达 ①石蜡切片后60 ℃烘烤10 min，二甲苯及梯度酒精脱蜡水化，PBS冲洗。②柠檬酸盐抗原修复20 min，自然冷却后，PBS冲洗。3 %过氧化氢溶液避光15 min后，PBS冲洗。③加入10 %山羊血清置于37 ℃封闭1 h，甩掉并滴加一抗(1∶200)置于37 ℃温育2 h，PBS冲洗。滴加二抗，室温30 min，PBS冲洗。④配制DAB工作液(1∶50)，光镜下控制显色。⑤苏木素复染后， 分别过1%盐酸酒精，水冲，梯度酒精脱水、二甲苯透明。⑥自然风干，封片，显微镜观察。

1.5 数据统计 所有数据以均数±标准误表示，数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，P<0.05和P<0.01认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型改善的肉眼观察 肉眼观察各组兔耳痤疮模型，空白对照组可见耳厚正常，硬度、粗糙程度正常，毛囊口无黑角栓。造模后可见耳部造模处皮肤增厚，粗糙，痤疮形成，红肿、糜烂明显。治疗后，与模型组比较，龙眼叶提取物及维甲酸局部给药后，皮肤增厚及粗糙表现改善，红肿程度减轻，皮肤表面糜烂好转(见图1)。

图1 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型改善的肉眼观察

2.2 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型改善的组织病理学观察 组织病理学HE染色观察发现，空白对照组各层细胞排列规则、紧密，无增厚等异常形态，真皮层内单一核细胞浸润。模型组各层细胞排列紊乱，角质层角化过度，颗粒层和棘层也相应增厚，毛囊角化过度，内有角栓形成，真皮浅层和毛囊周围有较多中性粒细胞浸润。龙眼叶提取物给药后对痤疮形成有较好的抑制作用，龙眼叶提取物0.2 g/mL和0.1g/mL组的表皮厚度明显减轻，各层细胞排列近乎规则，炎细胞浸润明显减少。维甲酸组和龙眼叶提取物0.05 g/mL组有不同程度改善(见图2)。

箭头所指为角化毛囊及增厚的颗粒层及棘层。图2 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型改善的组织病理学观察

2.3 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型外周血IL-1β和TNF-α含量的影响 兔耳痤疮模型外周血ELISA结果显示，模型组IL-1β和TNF-α含量明显升高，而龙眼叶提取物0.2 g/mL和0.1g/mL组及维甲酸组可降低外周血中IL-1β和/或TNF-α含量(见图3)。

vs空白对照，*P<0.05,**P<0.01; vs模型，#P<0.05,##P<0.01。图3 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型外周血IL-1β和TNF-α含量的影响

2.4 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响 兔耳痤疮模型免疫组化结果可见，表皮细胞内棕黄色部位为抗原阳性表达部位，抗体表达定位于表皮细胞的细胞质。与空白对照组比较，模型组兔耳痤疮模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表达明显增加；龙眼叶提取物不同给药浓度组及维甲酸组可不同程度降低兔耳痤疮模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表达 (见图4～6)。

图4 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型部位IL-1β蛋白表达的影响

图5 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型部位TNF-α蛋白表达的影响

vs空白对照，**P<0.01; vs模型，#P<0.05,##P<0.01。图6 龙眼叶提取物对兔耳痤疮模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响

3 讨论

痤疮是侵犯毛囊皮脂腺单元的一种疾病，在正常的代谢过程中，毛囊皮脂腺导管上皮细胞脱屑，皮脂腺携带脱屑从毛囊口排出，毛囊中寄生着大量的皮肤正常菌群，例如痤疮丙酸杆菌、需氧葡萄球菌等。皮脂大量分泌或皮脂腺导管异常角化等原因引起毛囊堵塞，毛囊内的菌群分解瘀滞的皮脂，产生游离脂肪酸，刺激毛囊产生炎症。痤疮好发于皮脂溢出部位，如颜面、前胸、后背。常表现为闭合性(白头)和开放性(黑头)粉刺。在粉刺基础上形成丘疹、脓疱、囊肿、结节，严重的可形成瘢痕。兔耳模型是最常用的痤疮药物抗角化实验模型之一，该模型于1941年发现，是研究痤疮比较公认的模型之一[9-10]。本研究利用浓齿轮油和痤疮丙酸杆菌复制兔耳痤疮模型，模型成功。

痤疮治疗临床多以抗生素、抑制皮脂分泌和内分泌调节药物治疗为主。文献报道龙眼叶提取物具有抗痤疮的潜在作用，王力等[11]从龙眼叶中分离出8个多酚类化合物，经波谱分析为鞣花酸、3,4-二甲基鞣花酸、儿茶素、没食子酸乙酯、没食子酸、山柰酚、槲皮素和山柰酚-3-o-鼠李糖等。龙眼叶具有清热解毒，解表利湿的功效。研究发现龙眼叶提取物可用于预防流行性感冒，流行性脑脊髓膜炎，感冒，肠炎；外用还可治阴囊湿疹[8]。本实验发现，龙眼叶提取物和阳性药维甲酸均可改善兔耳痤疮模型的皮肤增厚、粗糙、红肿、糜烂症状，可改善皮肤角质层角化和炎症细胞浸润，提示龙眼叶提取物具有一定治疗痤疮作用。

痤疮的发生与炎症密切相关。研究发现炎症早期粉刺腔内有中性粒细胞存在。而炎症的晚期，中性粒细胞导致毛囊壁破坏，断裂，使毛囊壁断裂，产生真皮损伤。此外，由淋巴细胞、异物巨细胞浸润构成的慢性炎症过程也参与痤疮的发生[11]。激素与皮脂腺内菌群与炎症及痤疮也有密切关系[2,12-13]。痤疮丙酸杆菌细胞壁的肽聚糖-多糖片段可能是涉及免疫反应的主要部位，刺激免疫细胞产生 TNF-α和 IL-1β等促炎症因子，痤疮的肿胀程度跟体内的IL-1β和TNF-α的含量呈正比[1,14-17]。 本实验发现，龙眼叶提取物和阳性药维甲酸可降低模型组引起的新西兰兔外周血中IL-1β和TNF-α含量的升高，降低兔耳痤疮模型部位IL-1β和TNF-α的蛋白表达，提示龙眼叶提取物抑制炎症因子释放。综上所述，在本实验条件下龙眼叶提取物对痤疮具有治疗作用，机制可能与抑制炎症因子释放有关，值得进一步研究。

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