乳蛋白及水解物对益生菌增殖的影响

李雪霞，张娜，杨晓婉

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省食品科学与工程重点实验室，哈尔滨，150076）

0　引 言

益生菌如嗜酸乳杆菌和双歧杆菌对健康有许多益处，越来越多地被应用到乳制品中。然而，益生菌若要获得所期望的效果，必须达到足够的数量和活力[1]。市场上益生菌产品的生存能力普遍较低，容易受周围环境的影响，从而导致食品中益生菌的数量不足，严重影响其发挥作用[2]，同时研究发现牛乳并不是益生菌生长的最佳培养基[3-4]，因此，许多研究试图改善牛奶及其制品的成分，以期促进益生菌增殖。

1　乳蛋白的主要组分及对益生菌增殖的效果

乳蛋白主要为酪蛋白和乳清蛋白两大类，具有含量丰富，分布广泛等特点。大量研究证实酪蛋白，乳清蛋白及二者的水解物均能促进益生菌增殖。

1.1　酪蛋白及其水解物对益生菌增殖作用

酪蛋白是乳中的含磷蛋白质，约为牛乳中总蛋白含量的80%[5]，自1953年，Gyorgy首次发现母乳促进双歧杆菌生长后，研究人员开始进一步研究和阐明母乳中的双歧杆菌促生长因子[6，7]。Azum a以质量浓度为10 g/L的κ-酪蛋白为原料，证实母乳κ-酪蛋白可作为婴儿双歧杆菌SI2（一株自母乳喂养的婴儿粪便中分离的菌株）促进生长因子，但用凝乳酶或胃蛋白酶水解后促生长效果更好[8]。Prou lx发现，最适于促进双歧杆菌生长的商业酪蛋白水解物中含有99.6%分子量小于2 000 u的小肽[9]，并在1994年发现通过A lcalase，糜蛋白酶或胰蛋白酶水解酪蛋白酸钠获得的多肽（M P）、氨基酸和小肽级分（AA）的分子质量分布，其中A lcalase水解的小于2 000 u的M P和AA含量最高分别为98.46%和99.02%[10]。同样，St-Gelais发现添加相对分子质量分布小于2000 u的酪蛋白水解物于培养基中能显著促进乳酸球菌W g2生长[11]。

酪蛋白水解物对不同的益生菌增殖的效果也不同，在2006年Zhang以酪蛋白为原料利用碱性蛋白酶在不同水解度条件下得到水解产物，以嗜酸乳杆菌的菌数作为考察指标，未水解的酪蛋白为对照，发现水解度为10.1%的水解产物对嗜酸乳杆菌的促进效果最为明显，为对照组的1.2倍[12]。同时，赵红宇对酪蛋白、乳清蛋白、乳清蛋白水解物和大豆水解物的促进益生菌增殖效果进行了比较，发现添加1%酪蛋白水解物对双歧杆菌Pba增殖效果最显著，与空白相比提高超过1 mL-1（对数值），同时发现嗜酸乳杆菌Ac，双歧杆菌In f'的生长（P＜0.05）也可以显著促进，其中双歧杆菌In f'增长近1个对数周期，而对于保加利亚乳杆菌3和嗜热链球菌9的生长基本没有影响，对数值仅为0.02 mL-1[13]；不同来源的水解物增殖效果不同，如与牛乳来源的酪蛋白糖巨肽（Casein glycopeptides，CGM P）相比，母乳来源的CGM P对双歧杆菌的增殖效果是牛乳来源CGM P的4倍[8]；酶的种类也会影响到增殖效果，如汤茜分别将牛乳κ-酪蛋白的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶酶解产物以及CGM P在体外培养24 h后都对双歧杆菌BBM N 68具有增殖效果，其中，增殖作用最强的是碱性蛋白酶水解产物，活菌数达到109mL-1[14]；酪蛋白水解物对益生菌具有促进作用的同时，也表现出对有害菌的不同程度的抑制效果，在连续给予小鼠喂食CGM P 15 d后，乳杆菌、肠杆菌科以及双歧杆菌数量显著增加（P＜0.01），大肠菌群显著减少（P＜0.05），而肠球菌没有显著变化[15]。

1.2　乳清蛋白及其酶解物对益生菌增殖作用

Janer等人用实验证明，从牛奶或从山羊和绵羊奶中共同提取的乳清蛋白的浓缩物（w hey protein concentrate，W PC），可以促进牛奶中乳酸双歧杆菌的生长。在牛奶中加入2%W PC培养24 h，活菌数可达109cfu/mL[16]。

1.2.1α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

从牛奶分离出来的α-乳白蛋白在氨基酸比例和结构，以及功能特性上与母乳都非常相似，这使α-乳白蛋白在“母乳化”婴儿配方食品中得到广泛应用[17]。Bury发现补充α-lactalbumin或β-lactoglobu lin可以达到同样添加量的W PC相同效果的63%，并发现促进乳酸菌生长的组分是热稳定的，在加热到121℃持续5 min并没有失去促进生长效果，提出促进乳酸菌生长的组分可能是a-核苷酸，非蛋白氮，或者一些细菌蛋白胨中所没有的特定热稳定肽[18]。Petschow和Talbot也提出除了α-乳白蛋白之外，β-乳球蛋白也是较好的促进益生菌生长的因子[19]。2007年，M iralles还证实糖基化的β-乳球蛋白对大肠杆菌具有杀菌作用[19-20]。

1.2.2乳铁蛋白

母乳喂养的婴儿与配方奶粉喂养的婴儿相比较体内的双歧杆菌和乳杆菌数要多，这是乳铁蛋白与母乳其他因子共同作用的结果[21]。双歧杆菌是乳铁蛋白耐性细菌，据报道乳铁蛋白促进双歧杆菌在体外和体内实验中的生长。Kim等在存在和不存在乳铁蛋白的情况下培养24 h后测试四种双歧杆菌菌株的生长，结果显示相对于没有添加乳铁蛋白的培养物，通过660 nm处的OD值测量发现全脂乳铁蛋白对短双歧杆菌，婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌具有适度的生长促进作用，但对长双歧杆菌无促进作用[22]。Yam auchi通过给予婴儿喂食包含牛乳铁蛋白婴儿配方奶粉，经体外实验发现乳铁蛋白促进短双歧杆菌JCM 1192数量增加约20%[23]。H u以新生猪为对象研究含重组人乳铁蛋白转基因牛奶对肠道菌群的调节效果，从肠道样本的细菌计数结果发现喂食富含乳铁蛋白乳粉的猪结肠中的双歧杆菌和肠道乳酸菌的数量分别为8.74和10.11 log cfu/g，比普通乳粉分别增加0.08和0.61 log cfu/g[24]。

表1　乳清蛋白和酪蛋白及其水解物对益生菌增殖研究概况

1.2.3乳清蛋白水解物（W PH）

国外学者发现一些益生菌在添加W PH的脱脂乳培养基中显著增长[25]。Cham pagne研究比较了保加利亚乳杆菌在乳清蛋白、W PH和牛乳中的生长状况，发现W PH的促生长效果优于乳清蛋白[26]。白凤翎的研究同样发现乳培养基中添加乳清蛋白水解物对乳酸菌生长的促进作用，其中对嗜热链球菌作用高于保加利亚乳杆菌近1.5 log cfu/mL。以W PH作为添加物，同时以乳清蛋白和乳清蛋白酸水解物作为参照物进行嗜酸乳杆菌B增殖实验，从600 nm处OD值可以看出，在37℃培养12 h后，与对照组相比，嗜酸乳杆菌B培养12 h的OD值平均比对照组高0.119，差异显著，说明在培养基中添加W PH会对嗜酸乳杆菌具有显著的增殖效果[27]。韦慧娟研究乳清蛋白水解物对干酪乳杆菌增殖实验，发现乳清蛋白水解物替代量为30%时干酪乳杆菌促生长作用最强，在分别培养4 h和12 h活菌数分别高达7.41和8.58 log cfu/mL，同时OD值也验证了这一变化趋势，分别为0.5和4.0左右[28]。

乳清蛋白和酪蛋白及其水解物对益生菌增殖研究概况整理如表1所示。

2　益生菌增殖作用研究所应用的技术

常用分析测定益生菌的技术有实时聚合酶链式反应和荧光原位杂交（FISH）技术，用于确定细菌菌数的方法还有重量法，吸光度（即比浊法）和活菌计数法。

2.1　实时聚合酶链式反应

实时聚合酶链式反应（real-tim e po lym erase chain reaction，R eal-tim e PCR）是一种定量测定样品中特定DN A序列的聚合酶链反应。即使用标记（最常用是荧光标记）的PCR引物，因而能够通过荧光监测到每一次PCR循环后扩增所得DN A产物的量，从连续监控下获得的反应动力学曲线，可推导得样品中被扩增模板DN A的原初含量。R eal-tim e PCR被广泛应用到乳蛋白促益生菌增殖作用的研究中。M artín在研究母乳含有双歧杆菌以及他们是否可以通过母乳喂养传播给婴儿的肠道的研究中应用real-tim e PCR测定母乳中双歧杆菌的数量[29]。江岩也采用了real-tim e PCR，分析不同剂量的乳源CGM P对小鼠肠道双歧杆菌增殖水平的影响[30]。而 Mullié使用 PCR检测法检测了双歧杆菌对21个健康用牛奶喂养的婴儿的粪便中的双歧杆菌进行研究[31]。田梅将real-time PCR法与常规细菌鉴定法进行了比较。研究通过对4662例腹泻患者的粪便标本同时进行real-time PCR法与常规细菌鉴定法检测，对其结果进行统计学分析，发现两种方法无统计学差异（P＞0.05），对real-time PCR检测阳性标本进行常规细菌鉴定法检测，阳性率为100%。研究证实real-time PCR法检测沙门菌与志贺菌结果可靠，检测时间短，更能满足临床诊断肠道疾病的需求[32]。

2.2　荧光原位杂交（FISH）技术

FISH是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化连接上荧光染料。FISH具有敏感、快速、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示于中期分裂相中，还能显示于同期核中。Bruck使用荧光原位杂交技术研究可能促 进由双歧杆菌主导的胃肠道微生物的生长的牛乳[33]。Sm ehilová应用此项技术比较了母乳喂养的过敏性结肠炎婴儿和健康婴儿的粪便菌群，应用FISH对双歧杆菌、大肠杆菌和酪酸梭菌活菌进行定量检测得出健康婴儿肠道内双歧杆菌数量最多，通过双歧杆菌选择性培养基培养的健康婴儿双歧杆菌细菌计数的对数值为（9.87±0.76）g-1，FISH程序检测到的双歧杆菌为9.94±0.46 log cfu/g。在过敏性结肠炎双歧杆菌婴儿检测双歧杆菌计数的对数值为（8.12±0.88）g-1，FISH检测的对数值为（8.27±0.32）g-1，两种方法检测结果无显著的差异[34]。FISH也被用于探讨CGM P对小鼠粪便微生物群的影响，FISH被证明是一个快速和相对低成本的检测方法，可用于进一步的理解人类肠道微生物[35]。

2.3　其他方法

除上述用来研究益生菌增殖的方法，还有一些用来测定益生菌菌数的方法，如重量法，吸光度（比浊法）和活菌计数法。其中，重量法作为经典的分析方法准确度高，但是重量分析法操作繁琐，耗时长，难以满足控制分析的需要，且在微生物操作中无菌操作困难，容易感染杂菌。该法一般不用于分析菌液浓度的变化。佟晓芳在一种益生菌发酵米乳的制备方法中就应用到了重量法[36]。吸光度（即比浊法）测菌液浓度来比较细菌生长情况在益生菌增菌中应用较多，该法操作简单，精确度高。张英春采用比浊法测定潜在益生菌生长曲线，从而研究益生菌促进人体健康和防止疾病中发挥作用[35]。张强在测定三株益生菌发酵特性中也应用了比浊法[37]。此外，最常用的活菌计数法即平板计数法，还有厌氧滚管计数法等[38]。培养基培养技术对此课题的研究是十分重要的，微生物培养基的酸碱度、凝胶强度和选择性等直接影响到培养基的质量。

3　结束语

随着经济的发展以及人们日益增长的对健康的强烈追求和渴望，益生菌及其制品成为研究的热点，被广泛地用于医学、食品、生物等领域，在食品领域，益生菌产品尤其是益生菌乳制品的开发越来越得到人们的重视，成为益生菌研究的主流方向。但乳蛋白对益生菌增殖作用的机制仍不明了，进一步研究和阐述乳蛋白对益生菌增殖作用的机制将进一步解决人们肠道健康问题。乳蛋白对益生菌增殖作用的研究报道还不够全面，基于益生菌对于人类健康的益处，进行相关研究更具有深远的意义，也将成为未来的发展趋势。

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