高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的高氯酸盐和氯酸盐

毕瑞锋

（诺安实力可商品检验（青岛）有限公司，山东青岛266002）

0　引 言

近年来，乳及乳制品中高氯酸盐和氯酸盐污染引起消费者和生产者的普遍关注。高氯酸盐是一种持久性污染物[1]，苜蓿、麦芽等饲料对高氯酸离子具有很强的生物富集能力[2]，且牛奶中高氯酸盐含量和动物高氯酸盐的摄入量呈明显的正相关[3-4]；氯酸盐是二氧化氯消毒产生的副产物。高氯酸盐和氯酸盐长期暴露对人体的影响主要表现为对甲状腺吸收碘离子的抑止，欧盟食品安全局（EFSA）设定高氯酸盐和氯酸盐的每日耐受摄入量（TD I）分别为0.3μg/kg b.w.和3 μg/kg b.w.。

目前高氯酸盐和氯酸盐的检测方法主要有离子色谱法[5-7]、离子色谱-质谱联用法[8-10]、液相色谱-串联质谱法[11-15]等。本文基于非修饰多孔石墨化碳柱分离的HPLC-MS/MS，建立了牛奶中高氯酸盐和氯酸盐的检测方法。

1　实 验

1.1　仪器和试剂

AB Sciex 5500 Q TRAP液相色谱—三重四极杆串联质谱仪；15 mL聚苯乙烯离心管；聚四氟乙烯针头过滤器。

高氯酸盐标准品溶液（质量浓度1 000 mg/L）；氯酸盐标准品溶液（质量浓度100 mg/L）；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC级）；乙酸（分析纯）；C 18粉；实验用水为超纯水（18.0 MΩ·cm）。

1.2　标准溶液的制备

移取100μL质量浓度为1 000 mg/L的高氯酸盐标准品至10 mL的容量瓶中，用超纯水定容至刻度，此为高氯酸盐高标储备液（质量浓度10 mg/L）；中间混标的配制：分别移取80μL高氯酸盐高标储备液和30μL质量浓度为100 mg/L的氯酸盐标准品溶液至10 mL的容量瓶中，用超纯水定容至刻度；工作标准溶液的配制：移取1 mL中间混标至10 mL的容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

1.3　色谱条件

Thermo Hypercarb色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μL）。流动相：A为1%（体积分数）乙酸水溶液；B为甲醇；梯度洗脱程序：0～5.0 min，95%A；5.0～6.0 min，95%A～5%A；6.0～9.5 min，5%A；9.5～10.0 min，5%A～95%A；10.0～15.0 min，95%A。流速为 0.4 mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL。

1.4　质谱条件

电离方式为电喷雾负离子源（ESI-）；检测模式为多反应监测模式（M RM）；电喷雾电压为-4 500 V；离子源温度450℃；其他质谱参数如表1所示。

表1　高氯酸盐和氯酸盐的质谱参数

1.5　样品前处理

准确移取2.00 g牛奶样品至15 mL离心管。加入6 mL乙酸+甲醇+乙腈（1+10+90，体积比）溶液，涡旋1 min，转速为3 500 r/min下离心10 min。移取2 mL上清液至15mL离心管，添加1 mL正己烷，涡旋，转速为3 500 r/min下离心5 min，取下层溶液过0.45μm针头过滤器至进样小瓶中。

2　结果与讨论

2.1　质谱条件的建立

分别配制浓度为100μg/L的高氯酸盐标准溶液，在负离子模式下进行母离子扫描，得到高氯酸根离子的母离子m/z 98.9（35C lO4-）和m/z 101.9（37C lO4-）。打开子离子模式，氯氧键断裂，分别失去一个氧原子和两个氧原子得到子离子，质荷比按照响应大小分别为m/z 82.9（35C lO3-）；m/z 84.9（37C lO3-）；m/z 66.9（35C lO2-）和m/z 68.9（37C lO2-），选择z/m 82.9作为定量离子，其他离子作为定性离子。

按照相同的方法得到氯酸盐的母离子为m/z 82.9（35C lO3-）和m/z 84.9（37C lO3-），m/z 66.9（35C lO2-）为定量离子，m/z 68.9（37C lO2-）、m/z 50.9（35C lO-）和m/z 52.9（37C lO-）为定性离子。同时对去簇电压和碰撞能量进行优化，优化后的质谱参数见表1。

2.2　色谱条件的优化

多孔石墨化碳（porous graphitic carbon，PGC）是一种特殊的固定性，其对在反相键合相色谱柱（C 18）上难保留的极性化合物具有很好的吸附能力，这种现象被称为“石墨的极性保留效应”（polar retention effect on graphite，PREG）[16]。以水为流动相、羧酸为电子改性剂可以实现无机阴离子在PGC柱上的保留和分离[17]，实验选择与质谱电喷雾离子源兼容的乙酸（体积比为1%）作为电子改性剂。通过调整流动相中甲醇的比例，考察了甲醇比例对两种无机阴离子保留值的影响，结果表明，两种无机阴离子保留因子的自然对数lnk与甲醇均呈较好的线性关系，流动相中甲醇比例增加，保留值增大。但甲醇比例大于10%之后，高氯酸盐逐渐出现峰形变宽，灵敏度降低。将流动相中甲醇比例设定为5%，可有效分离两种无机阴离子，同时保证分析物的峰宽和高灵敏度（图1）。

然而，按照上述流动相比例运行一段时间后，会出现柱压上升、保留时间漂移等现象，影响实验的重现性。其原因可能是PGC柱保留极性无机阴离子的同时吸附了其他非极性的基体杂质，在高氯酸盐和氯酸盐的分离条件下，固定相上的杂质不能洗脱下来，越积越多，导致柱压升高；由于杂质占据了目标物的活性位点，致使色谱峰保留时间发生改变。由于PGC柱传统的再生方式耗时且复杂，Bapiro等[18]建议用甲醇/水（95∶5，体积比）的流动相冲洗PGC柱，因此在目标物出峰后，流动相逐渐过渡到体积分数为95%甲醇并维持5 min（图2）。

图2中，cps全称为count per second，其物理意义为每秒检测到的离子个数。

2.3　样品前处理方法的优化

牛奶中主要有蛋白质和脂肪，样品前处理的目的是提取目标物同时去除蛋白质和脂肪等样品基体杂质。高氯酸盐和氯酸盐的提取溶剂主要有水、甲醇和乙腈。由于甲醇对牛奶中蛋白的沉淀效果较差，乙腈对蛋白的沉淀效果虽然好，但直接用乙腈提取牛奶时，容易出现乙腈相和水相的分层现象，以乙腈为主要提取溶剂，加入10%甲醇有效改善沉淀蛋白时乙腈相和水相之间的互溶性。由于酸性条件有利于蛋白质的沉淀，实验选用乙腈-甲醇-乙酸溶液（90∶10∶1，体积比）作为提取溶液。

实验考察了使用正己烷去除脂肪的效果，移取2 mL样品提取溶液至15 mL离心管中，分别加入1 mL正己烷，充分混合1 min后离心，过0.45μm滤膜后测定。净化效果可通过基质效应进行评价，基质效应=S2/S1（其中S1为标准品的响应值，S2为基质提取溶液添加标准品后的响应值扣除未添加时的响应值）。未净化的基质提取溶液表现为明显基质抑制效应，用正己烷净化后高氯酸盐和氯酸盐的基质效应分别为90.9%和94.6%，基质效应可以忽略，因此实验采用正己烷进行净化。

图1　甲醇比例对两种无机阴离子保留值k的影响

图2　高氯酸盐和氯酸盐的色谱图

2.4　线性范围与定量限

由于牛奶中普遍存在高氯酸盐的污染，较难得到用于配制基质匹配标准品的空白基质样品，并且按照1.5节方法处理样品，可以忽略基质效应，因此实验采用溶剂标准品校正法。稀释1.2节制备的工作标准溶液至1/40，1/20，1/10，1/5，1/2和1倍，得到一系列浓度的混合标准品溶液，在优化的色谱-质谱条件下进行测定。以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，结果（表2）表明，高氯酸盐和氯酸盐在相应的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.999。综合考虑样品量和提取溶剂体积，按照S/N≥10确定高氯酸盐的定量限（LOQ）为0.8μg/kg；氯酸盐的LOQ为3μg/kg。

表2　高氯酸盐和氯酸盐的线性范围、线性方程、相关系数（r2）和定量限

2.5　回收率和精密度

通过基质筛选，在一个污染水平较低的牛奶样品上进行5倍和10倍定量限两个浓度水平的添加回收试验，每个水平做6个平行，结果如表3所示，高氯酸盐的平均回收率分别为85.0%和83.8%，相对标准偏差（RSD）为3.0%和2.2%；氯酸盐的平均回收率分别为97.3%和86.0%之间，RSD为3.9%和8.8%。

表3　高氯酸盐和氯酸盐的添加回收率和相对标准偏差（n=6）

2.6　实际样品测定

采用该方法对大型超市售卖的7个牛奶样品（配料只含生牛乳）进行了检测，每份样品重复检测3次，结果如表4所示，高氯酸盐检出率为100%，质量分数为（7.6±0.3）～（33.9±0.4）μg/kg；4个样品检出氯酸盐，质量分数为（4.8±0.1）～（30.5±0.9）μg/kg，剩下3个样品的氯酸盐结果为阴性。

表4　实际牛奶样品中2种无机阴离子的分析结果（平均值±标准偏差） μg/kg

3　结 论

本文基于非修饰多孔石墨化碳柱的HPLC-MS/MS技术建立了牛奶中的高氯酸盐和氯酸盐的检测方法。该法充分考虑了前处理方法和仪器方法、色谱系统和质谱系统之间的匹配性与兼容性，检测过程简单快速，提高了样品检测的通量，适合批量牛奶样品中高氯酸盐和氯酸盐的日常监测和质量控制。

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