3种检测方法诊断结核性胸膜炎的对比分析

墙建军，夏 飞，雷应军，刘海潮，胡振红

(解放军武汉总医院，湖北 武汉 430070)

目前，肺结核仍然是严重危害人类健康的主要传染病，是全球关注的公共卫生和社会问题，也是我国重点控制的主要疾病之一。世界卫生组织(WHO)新出版了《2015年全球结核病报告》显示，2014年全球新发肺结核病人数为960万，我国为94万；全球患病率为174/10万，我国为89/ 10万；全球发病率为133/10万，我国为68/10万[1]。结核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)是胸膜对结核菌高度变态反应时产生的胸膜炎症，为最常见的胸膜疾病之一，其发病率与结核病疫情相关，传统检查手段敏感性和特异性均较差，胸腔积液抗酸杆菌检出率极低、培养阳性率低且耗时较长；胸膜活检阳性率达60%～80%，但为有创伤检查，不适合常规采用。γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assays, IGRAs)是近年来最为热门的结核病诊断方法，其中包括基于全血的酶联免疫吸附试验和基于外周血淋巴细胞的酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)。笔者通过对90例进行了T-SPOT.TB、结核蛋白芯片以及腺苷脱氨酶(ADA)检测患者的检验结果进行回顾性分析，以探讨T-SPOT.TB在结核性胸膜炎诊断中的价值。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2015年1—12月在我院接受诊治的胸腔积液患者90例，其中结核性胸膜炎50例(TBP组)，非结核性胸膜炎(非TBP组)40例。TBP组男39例，女11例；年龄18～84岁，平均48岁；病程1 d～3个月；患者症状、体征、各项检查结果及抗结核治疗效果均支持诊断。非TBP组男25例，女15例；年龄20～80岁，平均50岁；病程4 d～5个月；胸膜转移癌23例，肺炎旁胸腔积液8例，心功能不全7例，肺栓塞2例；肿瘤病例均经病理细胞学证实，其他疾病根据临床症状、体征、常规化验检查、影像学表现及疗效等证实。纳入标准: 患者均行胸腔穿刺或胸腔置管引流胸腔积液，行血清T-SPOT.TB、血清结核蛋白芯片、胸腔积液结核蛋白芯片、胸腔积液ADA等检查。结核性胸膜炎诊断标准: 胸膜活检提示典型的结核病表现；胸腔积液涂片或培养出结核分枝杆菌；除外其他原因引起的胸腔积液，抗结核治疗有效[2]。

1.2 检测方法

1.2.1T-SPOT.TB方法 采用T-SPOT.TB检测试剂盒(英国Oxford Immunotec公司)对血液样本进行检测。结果判读:第1孔为阴性对照孔，第4孔为阳性对照孔，如阳性对照孔出现斑点，说明试验成功。第2孔和3孔为测试孔，当混合多肽ESAT-6或CFP-10孔达到以下标准则判定为阳性结果：①如果阴性对照孔斑点数为0～5个，测试孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6个；②如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔斑点数≥2倍的阴性对照孔斑点数。如出现以下情况判定试验结果为“不确定”：①空白对照孔斑点数超过10个；②阳性质控对照孔斑点数少于20个(除非混合多肽ESAT-6或CFP-10孔根据结果解释和判断标准确定为阳性)。

1.2.2结核蛋白芯片检测方法 PBT-X2蛋白芯片阅读仪及结核蛋白芯片试剂盒均由南京大渊生物技术公司提供。操作方法严格按说明书进行，结果根据仪器厂家设置参数自动判别，分别打印出胸腔积液与血清中三种特异性抗体即脂阿拉伯甘露糖(LAM)、 16 kDa及38 kDa抗体，如果任意抗体检测阳性，结果判定为阳性。

1.2.3ADA测定 应用10 mL抗凝玻璃管收集胸腔积液10 mL，1 000 r/min离心5 min，取上清液用酶法(北京九强生物技术股份有限公司试剂盒，批号：12-1021P)测定胸腔积液ADA活性，参照试剂盒说明书进行诊断，ADA≥45 IU/L定义为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计数资料比较行2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1

2组3种检测方法阳性率比较 TBP组血清T-SPOT.TB阳性率明显高于血清结核蛋白芯片、胸腔积液结核蛋白芯片、胸腔积液ADA(P均<0.05)。非TBP组血清T-SPOT.TB阳性率与血清及胸腔积液结核蛋白芯片、胸腔积液ADA比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2

3种检测方法的灵敏性与特异性对比 血清T-SPOT.TB灵敏性明显高于血清结核蛋白芯片、胸腔积液结核蛋白芯片(P均<0.05)，但与胸腔积液ADA比较差异无统计学意义(P>0.05)；胸腔积液ADA灵敏性与血清及胸腔积液结核蛋白芯片比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。血清T-SPOT.TB特异性明显高于血清结核蛋白芯片、胸腔积液结核蛋白芯片及胸腔积液ADA(P均<0.05)；胸腔积液ADA特异性明显高于血清及胸腔积液结核蛋白芯片(P均<0.05)。见表2。

表1 3种检测方法阳性率对比 例(%)

注：①与T-SPOT.TB阳性率比较，P<0.05。

表2 3种检测方法的灵敏性与特异性对比 %(例/例)

注：①与T-SPOT.TB比较，P<0.05;②与ADA比较，P<0.05。

3 讨 论

蛋白芯片是近年来蛋白组学研究中的新方向。结核蛋白芯片系统是以微孔滤膜为载体，将纯化的结核菌LAM、16 kD及38 kD等3种抗原固相在同一膜片上，利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫标记显色后通过芯片阅读仪对不同抗原点阵的灰度值进行同步检测，从而对结核菌感染的情况进行诊断[3]。本芯片包被了以上3种抗原，只要其中任何一对应抗体与之反应即为阳性。从文献报道来看，结核蛋白芯片灵敏度偏低，陈邹阳[4]随机选择结核性胸腔积液和恶性胸腔积液患者80例行外周血结核蛋白芯片检测，灵敏性为72.5%，特异性为90.6%；陶波山[5]对102例结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清和48例非结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清分别用ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT 3种方法进行检测，结果示胸腔积液结核蛋白芯片灵敏性为52.9%，特异性为89.6%，血清结核蛋白芯片灵敏性为74.5%，特异性为93.8%；本研究中，血清结核蛋白芯片灵敏性、特异性分别为70.4%，50.8%，胸腔积液结核蛋白芯片灵敏性、特异性分别为69.6%，49.3%，灵敏性与上述报道一致，但特异性均低。

ADA是一种分布广泛的酶，催化腺苷转化为肌苷和脱氧腺苷为脱氧肌苷，在T淋巴细胞增殖和分化中发挥重要作用。ADA在淋巴细胞分化和单核细胞成熟为巨噬细胞的过程中起到一定作用，当发生结核性胸膜炎时，宿主通过细胞免疫抵抗结核分枝杆菌(MTB)感染，胸膜的淋巴细胞明显增多、活性增强，故ADA在胸腔积液中含量明显增高。Piras等最早报道ADA作为胸腔积液辅助鉴别诊断分子标识，之后围绕其对结核性胸膜炎的诊断应用价值有大量的研究。刘菲等[6]研究结果显示，胸腔积液ADA灵敏性、特异性分别为71.2%，92%。一项纳入63项研究、8 000例胸膜炎 (其中2 796例为结核性胸膜炎)患者的荟萃分析显示，敏感性、特异性分别为92%,90%[7]。本研究结果显示，胸腔积液ADA灵敏性、特异性分别为88.1%,72.9%。导致结果不一致的原因可能与检测方法多样、截断值不同有关，而其他因素如患者的免疫状况、种族、地区结核流行情况也可影响ADA水平和结果判断。血液中ADA主要存在于红细胞、粒细胞和淋巴细胞，其活性约为血清的40～70倍。尉艳霞等[8]回顾性分析91例经内科胸腔镜胸膜活检病理确诊为结核性胸腔积液(结核组49例)和恶性胸腔积液(恶性组42例)患者的胸腔积液及血清中ADA活性，结果表明，结核性胸膜炎和恶性胸腔积液的血清ADA均在正常范围，且两者的差异无统计学意义。陶波山[5]研究表明血清的ADA检测结核性胸膜炎组与非结核性组无显著性差异。基于血清ADA检测对结核性胸膜炎诊断价值有限，本研究未纳入该方法。

IGRAs是检测MTB特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素，以判断是否存在MTB的感染。目前国际上较成熟的IGRAs有2种:①采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测全血中致敏T细胞再次受到MTB特异性抗原刺激后释放的γ-干扰素水平，称之为全血检测或结核感染T细胞免疫检测；②采用酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)测定在MTB特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放γ-干扰素的效应T细胞数量，称之为细胞检测或结核感染T细胞检测。由于ELISPOT技术是从单细胞水平进行检测，可及时捕获细胞周围分泌的细胞因子，故敏感度更高。Dai等[9]检索了中文和英文的数据库，对检索到的36篇英文和25篇中文文献进行了荟萃分析，结果显示IGRAs的总体敏感度和特异度分别为85%和84%。Menzies等[10]对1966—2006年的相关文献和数据进行的荟萃分析结果显示，结核感染T细胞免疫检测和结核感染T细胞检测的总体特异度分别为97.7%和92.5 %。刘红等[11]回顾性分析2011年2—10月郑州大学第一附属医院收治的结核病疑似患者1 084例， 384例(35.4%)确诊为结核病患者，54例为实验室诊断，其中42例T-SPOT. TB结果阳性，敏感性为77.8%(42/54);330例为临床诊断，其中289例T-SPOT. TB结果阳性，敏感性为87.6%(289/330)。T-SPOT. TB的综合敏感性为86.2%(331/384)。李津等[12]报道，通过IGRAs检测胸腔积液诊断结核性胸膜炎的敏感性为90.1%，特异性为88.0%。另一项研究结果显示，胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度和特异度可以达到95.7%和100.0%，显著高于ADA(55.5%和86.3%)[13]。本研究血清T-SPOT. TB灵敏性、特异性分别为93.9%，90.2%，与文献报道相一致，显示血清T-SPOT. TB灵敏性、特异性明显优于结核蛋白芯片法，差异有显著统计学意义；血清T-SPOT. TB灵敏性优于胸腔积液ADA，但无统计学意义；血清T-SPOT. TB特异性优于胸腔积液ADA，差异有统计学意义。

IGRAs在不同地区、不同人群中的灵敏性和特异性均存在较大差异，此外，不同IGRAs产品使用的抗原、检测试剂、检测参数和界值设定等可能存在差异，对最终检测结果及其判读有一定影响。国家食品药品监督管理总局批准的IGRAs仅限于血液样本的检测，即IGRAs对体液或组织标本的研究尚未经过充分验证，不能得出可靠的结论；我院尚未开展胸水T-SPOT.TB，故未能进行胸水T-SPOT.TB对比分析。由于我院开展血清T-SPOT. TB较晚，样本数据量偏少，故研究结果有一定局限性，对T-SPOT. TB诊断结核性胸膜炎或结核病的临床应用价值做出更科学准确的评价仍需进行大规模研究。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015[M]. Geneva:World Health Organization,2015:1-30

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[3] Mouradian S. Lab-on-a-chip：applications in proteomics[J]. Curr Opin Chem Bio1,2002,6(1):51-56

[4] 陈邹阳. 结核蛋白芯片与胸水ADA在肺结核病诊断的意义[J]. 临床肺科杂志,2013,18(10):1907-1908

[5] 陶波山. 三种检测方法对结核性胸膜炎诊断价值的探讨[J]. 临床肺科杂志,2011,16(8):1289-1290

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