精子激动剂对无精子症患者的精子活力及胚胎发育参数的影响

彭礼繁，张小建，廖梅旭，李晓洁，余 鲲

(四川省医学科学院·四川省人民医院辅助生殖医学中心，四川 成都 610072)

卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是无精子症患者获得自己遗传学后代的重要辅助手段。在无精子患者中，男方的精子质量与临床妊娠结局是密切相关的。无精子症患者通过手术获得的精子数量非常稀少，行ICSI很难找到活动的精子，这对后期的胚胎发育和临床妊娠结局会造成不利影响。精子激动剂SperMagic是一种有效提高精子活力的激动剂，有报道发现它可以促进精子的能量激发，增强精子活力，缩短ICSI操作时间和改善ICSI妊娠结局[1～3]。本研究通过比较无精症患者应用精子激动剂SperMagic前后精子活力的改变，以及对受精率、双原核(2PN)率、卵裂率、可利用胚胎率、D3优胚率、临床妊娠率和着床率等胚胎发育参数的影响，探讨精子激动剂SperMagic在无精子症患者中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料2015年1月至2016年12月就诊于我中心行胞浆內单精子显微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的不孕周期患者95例，均获得患者的知情同意。男方排除重大疾病和遗传性疾病，根据第五版WHO标准诊断为非梗阻性无精子症，对其采用经皮睾丸穿刺精子抽吸术(Testicular sperm aspiration，TESA)获得精子。将行TESA-ICSI的患者依据是否添加精子激动剂SperMagic分为：使用精子激动剂SperMagic的新鲜精子组(A组)20例，使用精子激动剂SperMagic的解冻精子组(B组)54例和正常TESA精子组(C组)21例，其它行ICSI的严重少弱精子症患者为对照组(D组)647例。

1.2方法

1.2.1促排卵方案 采用常规长方案超促排卵，前一月经周期的第19～21日用曲普瑞林(达菲林，法国益普生公司)1.3～1.8 mg降调节，月经第2～3日查血黄体生成素(luteinizing hormone releasing hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)值，达充分降调节标准后用果纳芬(Gonal-F，瑞士Serono)或丽申宝(中国丽珠公司)促排卵，当超声检查显示至少3个直径≥17 mm的卵泡时，当日患者接受5 000～10 000 U的HCG(中国丽珠制药)以诱发卵泡成熟，32～36 h后，经阴道超声引导下采卵。

1.2.2精子获得及处理 由男科医生对患者直接采用TESA取精。如为取卵当日，采用1 ml注射器针头对睾丸组织充分撕碎后，行单层密度梯度离心法洗涤，置于室温备用ICSI。如为诊断性穿刺，经TESA获得的睾丸组织充分撕碎后镜下见到精子，立即行精子冷冻，保存精源。采用本实验室自配的20%甘油的精子冷冻液，与精子混悬液 1：1比例充分混合后，置精子冷冻管中，在液氮气相中悬吊暴露15 min后，投入液氮中冷冻保存。取卵日有成熟卵子即可解冻精子，方法是从液氮中取出冷冻管，迅速将其投入到38 ℃水浴5 min溶解后，用单层密度梯度离心法洗涤，置于室温备用ICSI。

1.2.3精子激动剂SperMagic的使用 该产品是美国专利局的注册产品，其主要成分为苯甲酸钠咖啡因和肌苷。每瓶0.5 ml。在ICSI前，用巴氏吸管吸取SperMagic 3μL左右，加入ICSI皿的精子悬液中，37 ℃保存5 min后，在倒置显微镜下找到运动的精子，制动后行ICSI。

1.2.4受精和胚胎培养 ICSI后18～19 h后观察卵胞浆内出现2PN为正常受精，其余为异常受精。受精卵在卵裂培养液(G-1)中继续培养至72 h观察发育情况，并进行胚胎分级。以胚胎细胞数≥6个，卵裂球大小较为均匀，碎片≤20%为可用胚胎。于取卵后72 h移植，移植胚胎数目1～2枚，胚胎移植后给予黄体酮支持黄体。移植后14 d左右测血hCG，移植29～31d行B超检查，发现孕囊即为临床妊娠。

1.3胚胎的评估标准按照本中心常规胚胎评分标准，48 h发育为4细胞，72 h细胞数为7～9细胞，碎片≤15%，大小稍有差异，即最大的卵裂球与最小卵裂球体积比<1.5，为第3天优质胚胎；72 h相比48 h有发育且细胞数4～12细胞、碎片程度≤ 30%，为可利用胚胎。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差或率(%)表示，组间两两比较采用t检验或卡方检验。P< 0.05为差异有统计学意义，P< 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1患者基本情况比较A、B、C、D组患者的年龄、不孕年限、促性腺激素(Gonadotropin，Gn)用量、Gn使用天数及获卵数等方面比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。C组患者的精子活力(0.9%)显著低于A、B、D组患者的精子活力(11.8%、10.1%、14%)(P< 0.01)。见表1。

2.2患者的胚胎发育情况及妊娠结局比较从精子活力、受精率、2PN率、卵裂率、D3优胚率、可利用胚胎率、临床妊娠率和着床率来看，C组患者显著低于其他三组(P< 0.01)。A、B、D组患者在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率和着床率等胚胎发育参数上组间两两比较差异无统计学意义(P> 0.05)。D组在D3优胚率也明显高于A组和B组(P< 0.01)。四组在多PN率上组间两两比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 四组患者的胚胎发育参数比较

＊与A，B，D组比较，P< 0.05

3 讨论

精子的选择对于ICSI临床妊娠结局十分重要，ICSI操作可能将有遗传基因缺陷的精子注射到卵子内，影响其受精、后期胚胎发育乃至妊娠结局[4]。有研究通过分析数千例ICSI治疗周期，发现精液中即使无活动精子，或无正常形态的精子，仍可能妊娠，关键在于是否找到一条活精子注射入卵子中[5]。有研究通过ICSI周期当中无精子症患者的积累分析，发现活动精子多的组，就更容易挑选到正常形态的精子，其临床妊娠率要明显高于活动精子少的组[6]。

精子激动剂SperMagic是美国专利局的注册产品，在短时间内可以显著提高精子的活力，并使其运动能力增强，应用在ICSI中具有很好的效果。研究表明[7]，它具有明显提高精子活力和运动能力的功能，尤其是对少弱精子、附睾和睾丸穿刺的精子有显著的效果。它通过増进精子的活力，可以极大地缩短精子注射和卵子体外操作的时间，提高受精率和可利用胚胎数量，直接或者间接地提高临床妊娠率。同时其对冷冻后因脂膜损伤和线粒体功能受损的精子(如捐精)具有显著増强其功能的作用。此外，精子激动剂SperMagic对于少弱精子，尤其百万条精子数目以下的患者，可免去ICSI，成功地尝试人工授精，明显地提高临床妊娠率。其作用机理为：①通过作用于精子脂膜上的钙离子通道，来增加钙离子的内流，激活钙离子偶联的信号传导系统，来增加精子微管的动力学，进而增加精子尾部的运动能力，提高精子的活力。②通过结合精子脂膜上的受体，激活受体偶联的信号传导系统，以及钙离子内流机制，来促进精子的获能和超激活运动。③通过促进精子尾部中段线粒体呼吸机制，来增加线粒体 ATP 的生成，进而为精子的运动提供能量。目前研究表明[8]：应用精子激动剂SperMagic对临床妊娠结局没有造成影响，短期观察没有降低胚胎发育潜能。它能显著性提高无精症患者的精子活力，使经解冻后无活力的TESA冷冻精子，转变为运动精子，极大地改善胚胎发育参数及临床妊娠结局，同时还有效的降低了取卵周期取消率。

本研究使用的精子激动剂SperMagic通过Ca2+离子信号通路来激活精子活力，促使其尾部摆动，增强精子运动能力，使原来不动的活精子摆动起来。无精症患者通过ICSI技术获得临床妊娠，精子的存活与否是非常重要的。通过TESA手术获得的精子预先冷冻保存起来，可防止因取卵日精子获取失败导致助孕取消，还可以实现日后对于无精子症患者的多次ICSI手术。本研究结果显示：无精症患者精液中添加精子激动剂SperMagic后，与未添加前相比，虽然其精子密度无改善，但是运动精子活力均得到显著地提高(P< 0.01)。

目前，有关精子质量与辅助生殖妊娠结局的研究逐渐被学者们引起重视。有报道发现在精液中应用精子激动剂SperMagic以后，患者ICSI的受精率、优胚率和临床妊娠率均高于对照组(P> 0.05)[9～12]。本研究结果显示，C组与A、B组相比较，在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率和着床率等胚胎发育参数上均较低。A、B组在添加精子激动剂SperMagic后，各项指标均有较明显的提高，与对照组有相近的妊娠结局。原因是在新鲜精子或解冻精子加入精子激动剂SperMagic后，通过精子脂膜上的Ca2+离子信号通路，促进钙离子内流并结合受体，使其获能，增强了精子活力，缩短了精子注射和卵子体外操作的时间，提高受精率、2PN率、卵裂率和可利用胚胎率，从而间接地提高临床妊娠率。本文分析原因是睾丸精子已完成减数分裂，在功能上具备卵子激活因子，可诱导内源性钙离子释放激活卵子，可以完成卵裂和形成正常胚胎。同时，本研究也发现了A、B组在D3优胚率上明显低于D组(P> 0.05)，究其原因无精子患者与对照组相比较，其精子的获得均通过TESA手术来完成，精子均来源于睾丸组织，精子成熟度和精子获能性均低于对照组。虽然从外观上来看，其活力与对照组没有明显的差异，其精子DNA碎片等参数可能远低于对照组，进而造成D3优胚率明显低于D组。

有研究发现等通过手术获取的睾丸精液中随机分组添加精子激动剂SperMagic，发现研究组的活动精子数量显著增多，试验组的睾丸精子每视野为0～1条活动精子，ICSI在体外操作时间明显降低，这与我们的研究发现是一致的[13]。他们的试验发现通过添加精子激动剂SperMagic，其受精率和着床率均有显著提高，这与我们研究也是一致的[14，15]。我们还发现试验组在受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率和着床率均显著高于对照组，可见精子激动剂SperMagic可以显著改善妊娠结局。

综上所述，精子激动剂SperMagic是一种很好的精子能量促进剂，能增强精子的尾部动力和提高精子的活力，通过对精子膜完整性的保护，减少氧自由基对精子内部的物理性损伤，对于精子超显微结构的异常也可以起到保护作用，在ICSI当中的应用具有很好的效果。精子激动剂SperMagic能够提高无精症患者睾丸精子的受精能力和后期胚胎发育参数，缩短ICSI对卵子的体外操作时间，有效地提高临床妊娠率及着床率，短期观察其对胚胎没有造成损伤。但是，国内目前对于精子激动剂SperMagic在临床上的应用报道还比较少，本研究的样本数量还远远不够，它在大样本中对于受精率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率、临床妊娠率和着床率等胚胎发育参数的影响，及其对子代远期影响还不是很清楚，需要今后进一步的大样本统计分析。

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