高效液相色谱法对新型吡啶类活性物质XY-4的纯度测定

穆敏婕，白 兰，陈换飞，陈 婷，谢达春，张 梅

(1.成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611372；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

近年来，随着分子生物学、基因组学及蛋白质组学研究的快速发展，众多癌症治疗靶标以及与癌症相关的信号传导通路组件被人类发现和确证。许多激酶的异常过表达直接导致了染色体的不稳定以及多种抑癌因子和癌蛋白调节通路的混乱，而在众多肿瘤治疗性靶点中，Aurora-A激酶近年来备受关注。

Aurora激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，包括Aurora-A、Aurora-B、和Aurora-C，以调控中心体的功能、两极纺锤体的形成以及染色体的分离而为人们所熟知[1]。其中，Aurora-A是Aurora激酶中研究最多也是最重要的一种亚型，位于中心体和纺锤体以及纺锤体微管，在有丝分裂初期开始上调，参与对细胞凋亡和有丝分裂的调节等。

本课题组在前期实验中，以Aurora-A为抗癌治疗靶点，利用计算机辅助设计技术设计并合成了吡啶类化合物XY-4，通过药理实验证明，XY-4对多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制其增殖的作用，对人肺癌A549细胞、H1299细胞、人胃癌HGC-27细胞以及小鼠黑色素瘤B16细胞均表现出良好的抑制作用。多种体外实验均显示，化合物XY-4是以Aurora-A作为抗癌治疗靶点的极具潜力的活性化合物。因此建立一种快捷简便、准确实用的分析方法测定其纯度，对于活性化合物的制备以及后续产品的开发研究十分必要。本文参考文献[2～9]，使用高效液相色谱法，对XY-4的纯度进行跟踪测试，指导化学合成。其制备方法如图1[10]：

图1 XY-4制备方法

1 材料与方法

1.1仪器高效液相色谱仪e2695，美国waters；PDA检测器2998，waters；电子天平JA1003，上海顺宇恒平科学仪器；超声清洗器KQ-2200，昆山超声仪器；实验室纯水系统KM-UPT-8/15/20，Millipore。

1.2试剂色谱甲醇，阿拉丁试剂公司；超纯水由纯水系统制备。

1.3方法

1.3.1色谱条件 色谱柱为Phenomenex Gemini 5 μm C18 110 A色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇/水(V∶V=75∶25)；流速1 ml/min；柱温30 ℃；检测波长230 nm；进样量为20 μl。

1.3.2样品准备

1.3.2.1标准品溶液 取XY-4标准品10 mg，精密称定，加入色谱甲醇溶解使成10 ml，精密量取1 ml该标准品溶液，稀释至0.1 mg/ml，过0.45 μl微孔滤膜后HPLC进样分析。

1.3.2.2供试品溶液 取XY-4供试品10 mg，精密称定，加入色谱甲醇溶解使成10 ml，精密量取1 ml该标准品溶液，稀释至0.1 mg/ml，过0.45 μl微孔滤膜后HPLC进样分析。

1.3.2.3阴性对照品溶液 取XY-4的合成原料2-氯-3-氰基吡啶、邻甲氧基苯甲酸等，按照投料比分别称取，不加入催化剂也不加热启动反应，原料混合后直接进行产物的后处理步骤，所得物质按3.2方法制备阴性对照品溶液。

1.3.3方法学考察

1.3.3.1阴性干扰试验 取1.3.2项下的三种溶液，按拟定的色谱方法进行测定。

1.3.3.2标准曲线的制备 精密吸取XY-4对照品液稀释成浓度分别为100、90、80、60、40、20 μg/ml的标准品溶液，按照上述色谱条件分别进样分析，记录峰面积，以XY-4的检测浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y进行线性回归分析。

1.3.3.3精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20 μl，连续进样6次，测定峰面积。

1.3.3.4稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后0、4、8、12、16、20、24 h时依照上述方法进样测定。

1.3.3.5重复性试验 取同一批样品，分别依法制备6份供试品溶液并测定含量。

1.3.3.6加样回收试验 称取已知含量的同一批，含量为950.4 mg/g样品1.052 mg共6 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入1 mg/ml XY-4对照品溶液 0.8、1.0、1.2 ml，依法制备供试溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。

2 结果

2.1方法学考察结果阴性干扰试验结果如图2所示，阴性对照品溶液的色谱图中，在XY-4相应位置无干扰峰出现，表明阴性对照组的其他成分对XY-4的含量测定无干扰；线性回归考察结果如图3所示，回归方程为Y=7093.9X-4606.5，r=0.9999(n=7)，结果表明，XY-4在20～100 μg/ml的浓度范围内与峰面积积分值线性关系良好；精密度试验，峰面积的平均值为706019，RSD为1.06%(n=6)，结果表明仪器精密度良好；稳定性试验结果，峰面积的平均值为705839，RSD为1.23%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定，符合测量要求；重复性试验结果如表1所示，XY-4平均含量为 950 mg/g，RSD为0.03%(n=6)，方法重复性良好；加样回收试验结果如表2所示，XY-4平均回收率为97.6%，RSD为1.45%(n=6)。

图2 阴性干扰试验高效液相色谱图 A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照品溶液

图3 XY-4标准曲线

样品序号XY⁃4含量(mg/g)平均值(mg/ml)RSD(%)1234569506951095059502950195029504003

表2 XY-4加样回收试验结果(n=6)

2.2样品测定结果取三批合成所得产品，依法测定，测得XY-4别为920.6、945.3及900.5 mg/g，经计算表明，产品XY-4纯度达98%以上，纯度较高。

3 讨论

Aurora激酶作为一个重要的抗癌药物靶点，吸引了大量制药公司及科研机构对其抑制剂进行研究，开发和改造，例如选择性Aurora-A激酶抑制剂MLN-8054、MLN8237、ENMD-2076，多重激酶抑制剂MK0457(VX-680)、ZM447493等[11]。所以，Aurora抑制剂的开发与改造对于癌症的治疗意义重大。

根据不同的适应条件以及要求，纯度的测定方法包括高效液相色谱法(HPLC)法，半定量的薄层色谱法(TLC)法，差示扫描量热(DSC)法，软电离质谱法和核磁共振(NMR)法等，而目前使用最多的就是高效液相色谱法。本课题从化合物XY-4的物理性质以仪器设备条件和可操作性等方面考虑，最终选择了操作简便，检测精确的高效液相色谱法来对XY-4化合物的纯度进行测定，并对测定方法进行了考察。

将XY-4标准品进行光谱扫描，在230 nm处有最大吸收，灵敏度最高且其余物质对XY-4的吸收影响最小，故选择230 nm为测定波长。试验中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水等不同流动相体系，结果采用甲醇-水(75∶25)为流动相时，分离较好且柱效较高，故选择甲醇-水(75∶25)为流动相。试验对方法的专属性进行了考察，辅料对XY-4的测定无干扰且绘制的标准曲线的相关系数达到0.9999。回收率反映了分析方法的准确度，反映了在确定分析条件下样本浓度测定的准确性，一般样品的回收率应该在85%～115%，试验结果中平均回收率达到97.6%，RSD为1.45%，说明该方法测定较为准确。同时，精密度试验中的RSD值为1.06%，结果表明仪器的精密度良好。

综上，本高效液相色谱法测定XY-4化合物纯度，简便易行，准确可靠，出峰速度快，峰形和分离度等均符合测定要求，适合跟踪合成反应进程和检测产品纯度。

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