原发性肝癌微波消融治疗前后三项血清学指标联合检测的临床研究

陈吉东，熊晏群，董 科，岳林先，陈 琴，罗 俊，吴 昊

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.超声科；b.手术室；c.普通外科，四川 成都 610072)

原发性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。小肝癌(单发，直径≤3 cm)大多数处于肝癌发展的早期阶段，也是临床治疗肝癌的重点。目前，微波消融治疗作为一种微创治疗方法，在技术上可达到直径≤5 cm的小肝癌的一次性完全适形灭活。现代影像学检查已能够及时反映肿瘤组织坏死的实体情况，但还需要寻找肿瘤组织坏死后的血液学监测指标[1]。临床希望能够找到一个重复性好、检测方便、并能及时反映肝癌微波治疗疗效的血液学有效评价指标，指导临床治疗。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是肿瘤组织中最重要的血管生成因子[2]。有研究表明，肿瘤组织局部缺血、坏死时，均可使VEGF分泌减少[3]。肿瘤的发生和发展与机体细胞免疫功能密切相关，血清可溶性白细胞介素-2受体(soluble interleukin-2 receptor，SIL-2R)是反应机体细胞免疫功能的重要监测指标[4]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)[5]是一种多功能细胞因子，也是最重要的促进肝再生的因子，吴福生等发现肝癌切除术后HGF浓度上升高峰出现在术后第3天，说明在术后早期肝再生过程启动。本课题应用ELISA法测定HCC患者微波消融治疗前后血清VEGF、SIL-2R和HGF含量的变化，通过对其变化的研究进一步为临床上HCC微波消融治疗的疗效判定以及预后提供一些血液学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料收集我院2012年11月至2016年6月行微波消融治疗的81例HCC患者，男68例，女13例，年龄36～84岁[(53.25±11.67)岁]，患者均经临床、影像学(图1、图2)确诊，最后经病理切片证实。无外科治疗指征或本人拒绝外科手术治疗者。纳入标准：采用 2011 年制定的“肝癌多学科综合治疗模式”或 BCLC 分期标准。均为Ⅱ期，无门静脉分支、肝静脉或胆管癌栓，且肝功能分级均为Child A级。肝癌结节大小根据CT测定，平均直径(3.86±1.17)cm。所有患者在微波消融治疗前及治疗后未接受任何其他治疗，并均于活检及治疗前填写治疗申请单并由本人或其家属签字同意。排除标准：患者有严重肝肾功能衰竭，严重凝血功能障碍，不能配合消融治疗的患者。

1.2方法

1.2.1治疗方法 治疗前用美国产Bard18g全自动活检枪在超声引导下经皮刺入肝脏肿块部位，切取肿块组织2～3块放入4%的甲醛液中固定送检。确定为HCC后，再采用中国南京康友公司KY-2000型微波凝固治疗仪，微波频率2450 MHz，最大输出功率100 W。局部皮肤常规消毒铺巾，用2%利多卡因局麻，在超声引导下将微波治疗针经皮肝穿刺入肿瘤内部中心部位(图3)，确定位置后开启电源开始治疗。治疗功率及时间根据肿瘤大小及周围组织情况具体制定，肿瘤直径小于3 cm者使用单支消融针，功率60～70 W，时间500～700 s；肿瘤直径3～5 cm者使用两支消融针，功率60～70 W，时间700～900 s，消融范围≥R+1.0 cm(R肿瘤最大直径)，可一次性原位适形杀灭肿瘤组织。于微波治疗后1个月行超声造影或增强CT检查判断肿瘤坏死程度。

图1 增强超声声像图 消融治疗前右肝病灶呈“典型快进高增强”，大小2.9 cm×2.7 cm。

图2 增强CT 示消融治疗前病灶也呈 “快进高增强”表现(↑所示)。

图3 增强超声声像图 在消退期准确地将消融针插入肿瘤中心(↑为消融针)。

1.2.2实验室检查 所有患者于微波消融治疗前1天、术后1天、术后7天、术后1月空腹采取静脉血3 ml，分离血清于-70 ℃储存备用。血清中VEGF和SIL-2R的测定采用ELISA法，VEGF和SIL-2R试剂盒(美国ADL公司)；血清HGF的检测采用HGF ELISA试剂盒(R&D公司)检测小肝癌患者血清HGF含量，检测步骤严格按照试剂盒操作说明书进行。从酶标仪上波长492 nm处读取OD值。以OD值为纵坐标，以标准值为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD值在标准曲线上查出其浓度值。

1.3统计学方法所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，两两比较采用q检验；多组间比较采用重复测量的单因素方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HCC的坏死程度微波治疗后1个月行增强超声检查(图4)和增强CT检查(图5)，81例患者均完全消融，且无肝内外新发病灶。

2.2微波消融治疗前后不同时间点血清VEGF、SIL-2R和HGF的含量水平变化血清VEGF、SIL-2R和HGF的含量在微波消融治疗前后均有较明显的动态变化。与术前比较，微波消融术后1天VEGF、SIL-2R的含量降低，但差异无统计学意义(P> 0.05)，HGF的含量升高，差异有统计学意义(P< 0.01)；术后7天、1月与术前比较VEGF和SIL-2R含量降低，而HGF含量升高，差异均有统计学意义(P< 0.01)；术后7天、1月与术后1天比较VEGF和SIL-2R含量降低，而HGF含量先升高而后降低，差异均有统计学意义(P< 0.01)；术后1月与术后7天比较VEGF的含量升高，但差异无统计学意义(P> 0.05)；术后1月与术后7天比较SIL-2R含量升高，而HGF的含量降低，差异均有统计学意义(P< 0.01)。见表1。

图4 增强超声声像图 消融治疗后1月评估，完全消融(大小4.0 cm×3.6 cm)

图5 增强CT 消融治疗1月增强CT复查，病灶已被消融完全，未见新发病灶。

项目术前术后1天术后7天术后1月VEGF270．12±66．87254．73±73．45165．05±77．40∗¤171．92±76．10∗¤SIL-2R1204．24±7731183．43±90．77676．40±99．03∗¤784．04±104．45∗¤#HGF771．84±277．60987．06±309．15∗1178．51±328．07∗¤802．05±330．09∗¤#

与PMCT治疗前相比，*P< 0.01；与PMCT治疗后第1天相比，¤P< 0.01；与PMCT治疗后第7天相比，#P< 0.01

3 讨论

微波消融作为一种微创治疗肝脏肿瘤方法，经过近20年的发展，已在临床上取得了非常好的疗效[6，7]。其不仅可达到直径≤5 cm的小肝癌的一次性完全适形灭活，还可激活机体的免疫力[8]。深入研究微波治疗后对促进肿瘤生长与转移复发的生长因子的影响，对进一步促进微波治疗具有深远的意义。

VEGF是目前已知体内促血管内皮细胞分裂增生活性最强的肿瘤相关血管生成因子[2]。VEGF及其受体(VEGFR)在肝癌组织中高表达，消融术后大量肝癌细胞被杀灭可以使VEGF分泌下降，消融术后会影响VEGF含量变化[1]。本实验研究结果表明微波治疗可以有效杀死肿瘤细胞，从而消除了VEGF的来源，进而抑制肿瘤组织及其血管的增生。微波消融后，血清VEGF的含量的变化，可独立反映肝癌组织的坏死情况，是一种简易有效的生物指标。但微波消融后1月，血清VEGF含量开始升高的原因尚需要进一步研究。

SIL-2R是由活化的T淋巴细胞及单核细胞产生。近年的研究表明SIL-2R在自身免疫性疾病、肿瘤患者的血清中可能显著的升高，与病程和疗效预后密切相关[8，9]。Stehlin采用灌注加热疗治疗肢体肿瘤，不仅可使原发灶治愈，而且可明显降低肿瘤的转移率，认为可能与加热治疗过程中，由肿瘤释放的肿瘤抗原刺激机体，产生抗肿瘤免疫应答有关[10]。肿瘤患者血中含有高水平的SIL-2R，可抑制T细胞的增殖。如降低血中SIL-2R的水平，则T细胞的增殖增强[11]。本研究结果显示在有效治疗后血清SIL-2R水平比治疗前明显下降，说明微波治疗除热效应破坏肿瘤细胞外，还具有提高机体免疫功能的作用。原发性肝癌患者消融后7天血清SIL-2R水平较术前有明显下降，考虑是治疗后肿瘤负荷的减少，减少了由肿瘤引起的体内激活淋巴细胞数量，并削减了瘤内浸润的淋巴细胞数量，使之释放SIL-2R减少，血清SIL-2R水平下降，从而间接反映了病情的好转。由此可见，消融治疗后血清SIL-2R水平的检测有助于疗效的判断。治疗后1月SIL-2R水平较介入后7天明显升高，可能与治疗后肿瘤所致的异常免疫反应依然存在，抑制IL-2作用的发挥[12]；这提示我们可行联合免疫治疗等综合治疗有可能取得更好的效果。

HGF为一种小分子多肽物质，具有促进肝细胞再生和抑制肝细胞凋亡的功能，还可促进肝癌细胞的运动，使肿瘤细胞更趋于扩散，通过促进上皮增生和活动，在体内刺激肿瘤血管的形成，促进肿瘤的生长和扩散。本研究表明，微波治疗后第1天血清HGF浓度较治疗前显著增高。治疗后1周血清HGF浓度达到峰值，较治疗前差异具有显著性，说明在微波治疗后的早期肝再生过程启动，间质细胞分泌了HGF以进行修复。这种修复过程在治疗后1月已经恢复至治疗前水平。同时，HGF还可通过其受体c-Met发挥作用。HGF的受体c-Met在肝细胞肝癌组织中的表达率很高[13]，少量的HGF便可刺激微转移病灶的生长。肝癌组织中c-met的过量表达为HGF提供了大量受体，因此HGF/c-met系统在消融治疗后复发中起着重要作用，降低HCG的浓度和抑制HGF/c-met信号传导通路是减少消融后复发和转移的一个重要措施。

总之，如何降低或消除肝癌患者血清中高水平的VEGF和SIL-2R，使机体免疫系统发挥正常的功能，可能是防治恶性肿瘤的一条新途径。因此消融治疗后监测血清VEGF、SIL-2R可以作为临床上疗效指标。微波治疗后，有效的控制HGF的浓度及封闭其受体c-Met，以削弱HGF与c-Met结合后的生物学效应，对抑制肝细胞肝癌的早期转移复发可能具有重要的意义。

[1] Zhan P，Qian Q，Yu LK.Prognostic significance of vascular endothelial growth factor expression in hepatocellular carcinoma tissue：a meta-analysis[J].Hepatobiliary Surg Nutr，2013，2，148-155.

[2] Pircher A，Wellbrock J，Fiedler W，et al.New antiangiogenic strategies beyond inhibition of vascular endothelial growth factor with special focus on axon guidance molecules[J].Oncology，2014，86：46-52.

[3] Ahluwalia A，Tarnawski AS.Critical role of hypoxia sensor--HIF-1α in VEGF gene activation.Implications for angiogenesis and tissue injury healing[J].Curr Med Chem，2012，19，90-97.

[4] 庄浩，孙磊，滕步伟，等.PHC患者手术前后血清IL-8、IL-10和SIL-2R检测的临床意义[J].放射免疫学杂志，2013，26(6)：738.

[5] 甘声通，胡向阳，陈若冰，等.肝细胞生长因子/c-Met信号通路在肝癌恶性行为中的作用[J].生命的化学，2017，37(3)：349-354.

[6] 熊晏群，陈吉东.超声引导下经皮微波凝固治疗肝癌的手术护理[J].实用医院临床杂志，2013，10(2)：146-147.

[7] 李丽珍，钟秋红，黄昌辉，等.超声引导下经皮微波消融与CT超声引导下肿瘤射频消融治疗原发性肝癌的临床比较[J].中国CT和MRI杂志，2017，15(1)：76-78+82.

[8] 林燕.外周血免疫指标与原发性肝癌微波消融预后的相关性研究[D].中国人民解放军医学院，2014.

[9] 沈桢，阎皓.射频消融与微波消融治疗原发性小肝癌安全性、有效性及对免疫功能影响的对比研究[J].现代中西医结合杂志，2016，25(33)：3659-3662.

[10]王健琳，刘颖.超声引导射频消融治疗原发性及继发性肝癌对免疫功能的影响[J].重庆医学，2013，42(26)：3097-3099.

[11]邬振国，陈永永，李楠.射频消融联合TACE治疗原发性肝癌患者疗效及对外周血T细胞亚群的影响[J].实用肝脏病杂志，2017，20(3)：324-327.

[12]Hombach AA，Abken H.Antibody-IL2 fusion proteins for tumor targeting[J].Methods Mol Biol，2012，907：611-626.

[13]Aydemir TB，Sitren HS，Cousins RJ.The zinc transporter Zip14 influences c-Met phosphorylation and hepatocyte proliferation during liverregeneration in mice[J].Gastroenterology，2012，142：1536-1546.