人釉原蛋白全长基因的提取与克隆

唐 渝，姚 静，冯小云，田 鲲，

(1.西南医科大学口腔医学院，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072)

早期形成的釉质基质几乎全由蛋白质组成，可分为釉原蛋白(amelogenin，Am)和非釉原蛋白(non-amelogenins)两类，其中釉原蛋白占80%～90%，在釉质成熟后则基本消失。人釉原蛋白由175个氨基酸组成，其序列主要由疏水残基和亲水C-末端构成[1]，通常被划分为三个区域：富含酪氨酸的N-末端序列；中央主要由X-Y-脯氨酸重复序列组成；由11个亮氨基酸残基组成的亲水性C-末端。

研究表明，釉原蛋白对牙釉质的形成与矿化有着重要作用：作为钙、磷等离子的储存池，在形成羟基磷灰石(hydroxylapatite，HA)的过程中缓冲钙离子[2]，并通过自组装形成“纳米球”聚集体；与羟基磷灰石和胶原都具有高亲和性，控制组织结构形成和釉质矿化，最终被磷灰石矿物替代[3，4]。在体外研究中已经证实釉原蛋白的矿化能力，但对其在体内的作用还需要进一步研究，同时由于RNA的选择性剪接和蛋白水解处理会产生许多不同的、短链形式的釉原蛋白肽出现在发育中的釉质中[5]，因此了解各个釉原蛋白肽的功能对透彻掌握釉原蛋白的生理特性至关重要。人类牙釉蛋白和其他动物的釉原蛋白氨基酸序列间有较高的同源性，分析发现其在进化上有同组聚类，但是聚类物种不同，水解片段在结构和序列上有巨大物种间差异[1，3，5]，故而各物种牙釉质显微结构不尽相同。为了更准确的模拟人类牙釉质独特的网球拍样编制结构，本研究锁定人体釉基质蛋白为模板，挑选因正畸目的需预防性拔除的发育期下颌第三磨牙，获得成釉细胞功能活跃期分泌的釉原蛋白。对人釉原蛋白的研究为后续了解釉原蛋白功能片段在牙齿发育及矿化过程中的作用奠定基础，同时对牙齿脱矿乃至龋病后釉原蛋白在体内引导羟磷灰石有序再矿化修复能力的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1人牙胚组织总RNA的提取完整取出2014年8月四川省人民医院口腔正畸科儿童釉质发育期下颌第三磨牙牙囊1例(图1)，用Hank’s液漂洗后以液氮冻存，-80 ℃保存备用。使用invitrogen TRIZOL试剂提取[6]人牙胚的细胞总RNA，对总RNA 进行浓度、纯度检测、琼脂糖凝胶电泳检测。

图1 下颌第三磨牙的曲面体层像

1.2引物设计根据GenBank公布的人釉原蛋白全长序列(GenebankM86932)，利用分子生物学软件Oligo 5.0和瑞典Pharmacia公司核酸分析软件DNA SIS分析并设计引物。设计特异性引物Am-F/Am-R用于釉原蛋白全长的扩增，并分别在相应引物上引入酶切位点Bam H I和Sac I。引物序列如表1，其中下划线为酶切位点。由北京六合华大基因有限公司合成实验所用引物。

表1 釉原蛋白全长引物

1.3逆转录合成cDNA第一链根据提取的人牙胚总RNA为模板，参考《分子生物学基本技术实验指导》[7]，采用M-MLV RTase进行逆转录，反应体系如表2进行逆转录(RT-PCR)合成cDNA第一链[8]。RNA于PCR仪70 ℃变性10分钟；冰浴后加入6.8 μl混合物，PCR仪42 ℃1 h，90 ℃10 分钟；-20 ℃保存备用。

表2 逆转录反应体系

1.4人釉原蛋白基因的扩增及检测PCR(聚合酶链反应)采用25 μl体系扩增人釉原蛋白基因，PCR反应体系如表3.1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，凝胶成像系统观察后拍照。

1.5人釉原蛋白全长的回收切出凝胶电泳中目标DNA片段所在条带，切碎加PN溶液(每100 mg凝胶加300 μl PN溶液)，50 ℃加热融化；溶液移至吸附柱后离心；取下吸附柱，弃废液，加600 μl 漂洗缓冲液清洗，并重复一次。置超净台上晾置5 分钟以去除漂洗缓冲液；将吸附柱置于新离心管，向柱子膜中央加入50 μl 60 ℃的洗脱缓冲液确保DNA完全溶解并洗脱，12000 rpm离心1分钟，回收的DNA片段即在离心管的液体中，保存于-20 ℃备用。

表3 聚合酶链反应体系

1.6人釉原蛋白基因的克隆构建人釉原蛋白基因与pMD19-T(图2)的重组质粒，制备大肠杆菌Top10感受态细胞，并将重组质粒转化感受态细胞，将感受态细胞于Luria-Bertani固体培养基平板上培养12 h后观察菌落。

图2 pMD19-T载体结构示意图

1.7重组克隆的筛选与鉴定从Luria-Bertani培养板上挑选白色菌落为重组阳性菌落，液体培养基过夜培养增菌，提取质粒，收集DNA溶液按表4测序PCR反应体系进行PCR鉴定。择一经PCR鉴定阳性的克隆菌质粒进行测序鉴定。ChromasPro软件结果读取：使用NCBI上的Blast程序及软件DNAMAN、Primer Premier5.0等进行碱基序列比对分析。将测序鉴定正确的克隆菌命名为 pMD19-T-Am并保存。

表4 测序PCR反应体系

2 结果

2.1人牙胚组织细胞总RNA提取的质量分析经过超微量分光光度计检测，A260/A280为1.99，A260/A230为2.08，表明提取的RNA质量高，可用于后续实验。细胞总RNA的凝胶电泳结果如图3，图中RNA条带清晰，28 S条带约为18 S条带亮度的2倍，无弥散带，表明所获得的RNA无明显降解。

图3 人牙胚细胞总RNA M：DM2000 maker；1：总RNA

2.2人釉原蛋白基因的扩增以人牙胚RNA为模板，以Am-F/Am-R为引物扩增釉原蛋白全长基因并进行1%琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为570 bp的特异性条带，与预期一致，见图4。

图4 PCR扩增釉原蛋白全长基因 M：DM2000 maker；1：Am

2.3人釉原蛋白基因的质粒鉴定将釉原蛋白基因与pMD19-T载体连接构建质粒，以质粒为模板，以Am-F/Am-R为引物进行PCR鉴定，产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳后，扩增产物大小与预期一致。将鉴定的阳性菌进行测序，结果与NCBI公布的序列一致，表明获得了釉原蛋白基因的阳性克隆质粒。

3 讨论

成熟的牙釉质是一种高度矿化的组织，其重量的96%～97%均为无机物，而发育中的釉质则几乎全由蛋白质构成，其中釉原蛋白约占90%[9]。随后矿物质在基质中沉积，蛋白质和水被吸收，如此交替反复长达数年，直至最后达到96%的矿化程度。在分泌期的釉基质中常见到釉原蛋白自组装形成的20 nm大小的“纳米球”(nanospheres)超分子结构，在釉质晶体成核、生长方向和速度调控上发挥重要作用。

本实验挑选了出于正畸目的需预防性拔除下颌第三磨牙的正畸儿童，得到其釉质形成期的下颌第三磨牙牙囊，此时正是成釉细胞分泌釉原蛋白最多的时候，能够得到浓度较高的釉原蛋白。釉原蛋白在釉质发育过程中由成釉细胞分泌，当釉质形成整个厚度后，成釉细胞的细胞器数量减少，体积缩小并变短。釉质发育完成后，成釉细胞失去分泌釉原蛋白的功能，成为缩余釉上皮的一部分。研究发现，釉原蛋白可以控制晶体生长并调节羟基磷灰石(HAP)错综复杂的微观结构[10]。

实验中提取高质量的RNA是后续实验成功的保障，因此对细胞总RNA的质量检测很有必要。纯RNA样品A260/A280的比值为1.7～2.1。经过超微量分光光度计检测，所提取的RNA 的A260/A280为1.99，A260/A230为2.08，提取的RNA质量好，可用于后续实验。

根据GenBank公布的人釉原蛋白全长cDNA序列设计引物并引入了限制性酶切位点便于克隆，从人牙胚组织中通过RT-PCR技术获得釉原蛋白的编码序列，通过PCR和凝胶电泳显示所得到的条带无弥撒带，清楚单一。后与pMD19-T载体连接进行TA克隆后筛选白色菌落并进行测序鉴定，pMD19-T 载体是高效克隆PCR产物的专用载体，其β-半乳糖苷酶的表达活性较高，菌落所显示的蓝色更深且所需时间更短，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。使用NCBI上的Blast程序及软件DNAMAN、Primer Premier5.0等对碱基序列进行比对分析发现与NCBI中的序列完全一致，证实已经克隆了人釉原蛋白基因。为后续釉原蛋白基因功能片段的功能探索奠定基础。

本实验选取了处于釉质发育过程中的人牙胚组织获取细胞总RNA，通过RT-PCR技术获得人釉原蛋白全长基因，与pMD19-T 载体构建质粒进行克隆，并进行测序鉴定。结果表明初步获得了人釉原蛋白基因的阳性克隆载体，为后续在原核细胞中的表达奠定了基础。

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