USP6基因重排检测在动脉瘤样骨囊肿病理诊断中应用的初步探讨*

杨邵敏 由江峰 齐双双 王 华

(北京大学基础医学院病理学系，北京 100191)

动脉瘤样骨囊肿(aneurysmal bone cyst，ABC)是一种具有局部侵袭性的良性骨肿瘤，受累骨发生膨胀性破坏。经典的ABC病变由含有血液的多房囊腔构成。多种良性和恶性骨病变可以发生出血和(或)囊性变，类似ABC结构，称为继发性ABC[1]。原发性和继发性ABC从临床和影像学上经常难以鉴别。病理检查在送检样本较少或者病变表现不典型时经常难以确诊。目前，原发性和继发性ABC的病理诊断主要依靠常规H&E染色切片的形态观察，依赖于病理医生的经验和主观判断，没有客观的免疫组化和分子诊断指标。

Oliveira等[2]报道原发性ABC病变中存在泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP6)基因的断裂和易位，而继发性ABC中未发现此改变。虽然USP6基因的断裂重排在原发性ABC发病机制中的作用尚不太明了，但其可以作为原发性和继发性ABC病理诊断的客观辅助标准[2]。

对于病理科常规的福尔马林固定石蜡包埋组织，染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测是较为实用的染色体重排检查方法，比核型分析和逆转录PCR(RT-PCR)方法更适用于临床。FISH法可以原位观察组织，少量样本即可检测，样本制备处理相对简单，是病理科常用的分子检测方法。本研究收集2015年1月～2017年8月北京大学第三医院及外院申请病理会诊的可疑ABC 20例，探讨FISH法检测USP6基因断裂重排的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本组20例，因常规病理H&E染色难以鉴别原发性或继发性ABC，申请做USP6基因FISH检测。男9例，女11例。年龄7～46岁，平均17.7岁。脊柱病变16例，桡骨病变2例(其中1例位于桡骨表面)，肋骨病变2例。MRI检查均显示为溶骨性膨胀性骨破坏，病变边界清楚，呈多房囊性或囊实性，囊内可见液-液平面，提示存在动脉瘤样骨囊肿。9例行穿刺活检，11例为手术刮除或切除标本。具体见表1。

表1 20例ABC的资料和诊断

注：C：颈椎；T：胸椎；L：腰椎；ABC：动脉瘤样骨囊肿

1.2 标本处理和病理诊断标准

送检组织常规福尔马林固定、石蜡包埋。含有质硬骨组织的样本经10%甲酸脱钙液处理至软化可以切片。H&E染色切片由2名以上资深骨关节专业病理医师阅片。

原发性ABC的病理诊断按照2013年WHO软组织和骨肿瘤分类[1]，有如下特点：病变含有囊壁样结构，囊壁主要由增生的梭形细胞构成，细胞密度中等，异型性不明显，分裂象可多可少，但无病理性核分裂象。囊壁分布多核巨细胞，部分病例可见编织骨(图1～3)。当病变中实性结构多见，仅局灶有不明显囊腔形成，详细检查未见其他原发病变时，提示为实性ABC(图4、5)。

1.3 FISH染色方法及结果判读

ZytoLight SPEC USP6双色分离探针试剂盒购自CytoVision公司(ZytoVision GmbH，德国)。探针位于染色体17p13.2，基因近端(近着丝粒)探针标记红色荧光，基因远端(近端粒)探针标记绿色荧光。

FISH染色按标准步骤进行，简要如下：切片厚度为4 μm，65 ℃烤片过夜，依次脱蜡、水化，经蛋白酶K(100 mg/L)消化20分钟，滴加探针，杂交仪中37 ℃孵育过夜。4’,6-联脒-2’-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2’-phenylindole，DAPI)复染后荧光显微镜下观察。

FISH结果由2位病理医师单独判读：至少计数100个不重叠的细胞核，红色信号和绿色信号距离>2个信号点直径视为阳性细胞。参照文献[2]，阳性细胞比例>7%视为分离重排阳性。

病理诊断与FISH结果判读分别由病理诊断医师和分子检测医师完成。

2 结果

20例结果见表1。

经FISH检测，18例获得可判读的良好荧光信号；2例检测不成功，荧光信号无法判读，均为经酸脱钙后的手术标本。9例穿刺小标本均获得质优的可判读荧光信号。

9例USP6基因断裂重排阳性：结合常规病理组织学特点，确诊7例普通型ABC和2例实性ABC，其中1例位于桡骨表面，支持骨表面原发性ABC。阳性病例均为17号染色体二倍体，阳性细胞中可见1个黄色信号(红色和绿色信号重叠)、1个红色信号和1个绿色信号(图6)。8例阳性细胞比例为50%～70%，1例阳性细胞比例为10%。

9例USP6基因断裂重排阴性，只能观察到黄色信号，红色和绿色信号分离的阳性细胞计数<1%；经术后标本全面检查，4例在病变某些区域发现有骨巨细胞瘤(2例)、骨母细胞瘤(1例)、纤维结构不良(1例)成分，从而确诊为继发性ABC(图7～9)。另5例切除标本全面检查仍未见其他原发病变，符合原发性ABC的病理组织学特点。

本研究共成功检测14例原发性ABC和4例继发性ABC。FISH法检测USP6基因断裂重排诊断原发性ABC的敏感性为64%(9/14)，特异性为100%(4/4)，准确率为72%(13/18)。见表2。

图1 原发性ABC，病变一侧为囊壁结构(H&E染色 ×10) 图2 原发性ABC，囊壁由梭形细胞、多核巨细胞和炎症细胞构成(H&E染色 ×40) 图3 原发性ABC，囊壁编织骨形成(H&E染色 ×20)图4 原发性ABC，实性ABC中囊腔结构不明显，仅局灶可见出血(H&E染色 ×4) 图5 原发性ABC，实性ABC由梭形细胞、多核巨细胞和炎症细胞构成(H&E染色 ×40) 图6 原发性ABC，USP6基因分离探针FISH检测可见红绿分离的阳性信号 图7 骨巨细胞瘤继发ABC，可见含血的囊腔(H&E染色 ×20) 图8 骨巨细胞瘤继发ABC，病变其他区域可见骨巨细胞瘤成分(H&E染色，×20) 图9骨巨细胞瘤继发ABC，FISH检测显示红绿信号重叠呈黄色，未见分离

表2 FISH法检测USP6基因断裂重排诊断原发性ABC的价值

3 讨论

ABC是一种良性骨肿瘤，具有局部侵袭性，以往曾被认为是反应性增生。Oliveira等[2]报道原发性ABC存在染色体17q13上USP6基因平衡易位，提示病变为肿瘤性。目前发现的易位伙伴基因包括CDH11、ZNF9、COL1A1、TRAP150和CMD。USP6即泛素特异性蛋白酶[3,4]，染色体重排使USP6基因的编码区与上述伙伴基因高度活跃的启动子区结合，上调USP6基因转录，使Jak1去泛素化，活化Jak1-STAT3信号通路[5]，可能与骨母细胞成熟阻滞和基质金属蛋白酶产生异常有关[6,7]，参与疾病发生发展。未发现继发性ABC中存在USP6基因的易位重排[2]。

原发性ABC可发生于任何骨，最常见于长骨干骺端，特别是胫骨、腓骨、肱骨，其次是椎体后侧附件。本组脊柱病变多，与北京大学第三医院骨科以收治脊柱患者为主有关。ABC通常发生在髓腔，少数发生在骨表面(骨表面ABC)[8]。大约1/3 ABC为继发性。本组以及Oliveira等[2]的报道均显示，USP6基因分离重排对原发性ABC的特异性为100%，敏感性接近70%。USP6基因的FISH检测在分子水平上为甄别原发性ABC提供帮助。本组USP6重排阴性的9例中，4例术后全面检查在病变局部发现骨巨细胞瘤、骨母细胞瘤、纤维结构不良病变，5例USP6基因易位重排阴性的原发性ABC可能与不同于USP6的其他基因有关，其发病机制有待进一步研究。另外，原发性ABC特别注意需要与血管扩张型骨肉瘤鉴别，两者均好发于20岁以下年轻人，组织学表现有某些相似性，USP6基因重排检测从分子水平为两者鉴别提供帮助。本组1例(例2)发生在桡骨表面，临床考虑不能除外骨肉瘤，USP6基因易位检测支持骨表面的原发性ABC诊断，避免过度治疗。也有少数发生在软组织的原发性ABC[8]，以及个别转移的病例报道[9]。这些少见部位和临床表现不典型病例是否为真正的原发性ABC，需要遗传学证据的支持。

原发性ABC的治疗有手术和非手术方式，如栓塞治疗、狄诺塞麦(denosumab)药物治疗等[10,11]。对于脊柱等手术难度较大的病变部位，以及年龄较小的患者，损伤较小的治疗方式更为适用。常在治疗前进行穿刺活检排除骨巨细胞瘤、骨肉瘤等继发性ABC。但因穿刺获得的组织量较少，给病理诊断带来极大挑战。较小穿刺标本组织固定一般较为及时充分，不需长时间经酸脱钙，FISH检测更为稳定。本组9例穿刺样本全部获得满意的荧光信号，其中4例阳性，从而使较少的送检样本即得以确诊，避免过大手术。经酸脱钙的手术标本可能因组织处理而影响探针杂交，本组11例手术标本中2例检测不成功。

实性ABC是一种较为少见的病变，呈囊实性，缺乏经典ABC的海绵样腔隙，以较多间隔较厚的实性区为主，临床和病理表现不典型[12]。本组14例原发性ABC中2例经FISH检测确认为实性ABC，与本组申请基因检测的病例以疑难病例为主有关。实性ABC的组织学特点是：梭形细胞弥漫性增生，细胞核无多形性，含有散在、簇状分布的破骨样巨细胞，钙化的纤维黏液样间质，有骨母细胞分化和骨样组织产生。这些组织学表现与典型原发性ABC的囊壁结构相同，但缺乏囊腔结构，单纯根据组织学表现经常难以确诊[12～14]。

巨细胞修复性肉芽肿发生在颌骨和手足小骨，组织学表现与实性ABC类似。研究显示手足小骨的巨细胞修复性肉芽肿也存在USP6基因易位，提示病变本质是ABC，而颌骨类似病变均为阴性，因此有学者建议将手足小骨的巨细胞修复性肉芽肿诊断为实性ABC[15]，而颌骨的巨细胞修复性肉芽肿是不同于ABC的病变。

USP6基因重排也见于大约90%的结节性筋膜炎[16]，这是一种间叶组织病变，含有大量增生的纤维母细胞，病变通常细胞丰富，是一种假肉瘤性肌纤维母细胞增生，可自发消退，以往被认为是对创伤的反应，目前认为是一种软组织肿瘤。USP6基因重排同样见于结节性筋膜炎的类似病变——骨化性肌炎[17]，有学者认为最好把此两种病变统一归为软组织的ABC，此类病变中USP6基因最常见的易位伙伴是MYH9基因，位于22q12.3，该易位伙伴并未发现于骨的ABC。此类病变也可应用USP6基因FISH进行检测。

综上，利用FISH法检测USP6基因重排阳性是一种实用有效的原发性ABC的辅助诊断方法，特别有助于少量样本、临床病理学表现不典型原发性ABC的诊断。但由于本病少见，本研究样本量较少，确切结果尚待积累更多病例。

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2 Oliveira AM,Perez-Atayde AR,Inwards CY,et al.USP6 and CDH11 oncogenes identify the neoplastic cell in primary aneurysmal bone cysts and are absent in so-called secondary aneurysmal bone cysts.Am J Pathol 2004,165(5):1773-1780.

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