儿童急性祖B淋巴细胞白血病Ig和TCR基因重排的特征及其临床意义

高 超 赵晓曦 刘曙光 张元元 林 巍 张瑞东

急性淋巴细胞白血病(ALL)是B和T淋巴细胞分化阻滞于某一不成熟阶段，并且发生克隆性扩增的血液系统恶性疾病。淋巴细胞发育的早期阶段发生体细胞V(D)J重排，可产生具有高度多样性的抗原受体，即免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)。虽然Ig和TCR基因重组机制相同，但在正常情况下，B和T系的系别特异性在发育分化过程中被严格调控，Ig和TCR基因重排，也被称为免疫基因型，分别是B和T淋巴细胞特异性的标志，但在恶性淋巴细胞中则可出现跨系表达的特点[1]。Ig和TCR基因克隆性重排的检测可作为临床诊断白血病和淋巴瘤的辅助指标，并且作为分子靶标广泛应用于ALL的微小残留病(MRD)监测[2-5]。既往研究显示，儿童B细胞前体-ALL(BCP-ALL)Ig和TCR重排模式与患儿年龄和特定的染色体易位相关[6-7]，其克隆特性还与患者的预后有关[8]。

BCP-ALL根据白血病细胞的发育阶段可分为祖B(pro-B)ALL、普通B(common-B)ALL和前B(pre-B)ALL 3个类型，其中祖B-ALL为最不成熟的B淋巴细胞原始细胞，CD10不表达，由于其在BCP-ALL中的发病率较低，因此其Ig和TCR基因重排特点尚缺少详细的研究报道。此外，虽然祖B-ALL的免疫表型相同，但患者的免疫基因型却可能存在差异。本研究对首都医科大学附属北京儿童医院(我院)收治的祖B-ALL初诊患儿的IgH、IgK、IgL、TRD、TRG和TRB基因重排发生率及克隆特性进行分析，并探讨其与患儿临床和生物学特征及预后的相关性，为进一步阐明祖B-ALL发生发展机制提供参考依据。

1 方法

1.1 知情同意和伦理 本研究进行Ig和TCR基因重排检测和临床资料收集均取得患儿监护人的知情同意。研究方案获得我院伦理委员会的批准。

1.2 纳入标准 ①2003年4月至2009年12月我院收治的祖B细胞ALL初诊患儿；②生物样本库有足量的临床检查剩余骨髓样本用于进行Ig和TCR基因重排检测。

1.3 分组 以初诊IgH、IgK、IgL、TRD、TRG和TRB基因重排情况作为分组依据，各标志中检出单克隆、双克隆和寡克隆重排[9]者为阳性组；多克隆[9]和无重排者为阴性组。阳性组根据重排克隆特性分为单克隆亚组和双/寡克隆亚组。

1.4 Ig和TCR重排分析

1.4.1 骨髓样本基因组DNA提取 根据DNA提取试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)说明书提取骨髓冻存样本的基因组DNA，经紫外分光光度计测定DNA样本的纯度和浓度。

1.4.2 PCR扩增 采用BIOMED-2研究[9]中的多重PCR引物扩增Ig和TCR基因，包括①IgH：VH-DH-JH、DH-JH；②IgK：VK-JK、VK-Kde、Intr-Kde；③IgL：Vλ-Jλ；④TRD：Vδ-Dδ-Jδ、Vδ-Jδ、Vδ-Dδ、Dδ-Dδ；⑤TRG：Vγ-Jγ；⑥TRB：Vβ-Dβ-Jβ、Vβ-Jβ、Dβ-Jβ。其中，V(D)J为完全重排，DD或DJ为不完全重排。PCR扩增体系见表1，使用Roche公司所产Taq酶及其配套缓冲液。PCR反应条件：95℃ 7 min，95℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环。

表1 多重PCR 方法检测Ig/TCR基因重排反应体系

1.4.3 异源双链反应和电泳分析 将PCR产物于95℃变性5 min，迅速置于冰上1 h，进行异源双链反应。取5 μL反应后的PCR产物行6%丙烯酰胺凝胶电泳，恒压100伏，90 min。电泳结束后，采用银染法进行显色分析。

1.4.4 结果判读[9]在目的片段位置出现单一条带且边缘清晰者为单克隆基因重排，出现2条为双克隆或双等位基因重排，2条以上条带为寡克隆重排，目的条带位置上方为模糊涂片样为多克隆重排。

1.4.5 克隆性重排序列分析 克隆性重排样本经纯化后送至上海生工生物工程技术服务有限公司，采用ABI PRISM 3730型测序仪进行测序，序列经BLAST和IMGT数据库比对。

1.5 免疫表型检测 取肝素抗凝骨髓2 mL(标本中原始及幼稚细胞≥30%)，分离单个核细胞，将骨髓细胞浓度调至2×107·mL-1，取50 μL骨髓液与异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体各1种(每种20 μL)以及10 μL PC5标记的CD45单克隆抗体混匀，室温反应30 min，清洗1次，加入100 μL多聚甲醛固定15 min，离心弃上清，加入溶血剂裂解红细胞，离心弃上清，最后加入1%多聚甲醛1.5 mL，置于流式细胞仪(FACS Calibur，Becton Dickinson公司产品)检测并分析。胞浆抗原的检测参照IntraPrepTM渗透剂说明书进行。荧光抗体及渗透剂购自法国Immunotech公司和美国Pharmingen公司。所用抗体包括FITC标记的MsIgG1(同型对照)、CD2、CD7、CD10、CD20、CD33、HLA-DR、CyIgM、Igλ、MPO，PE标记的MsIgG1(同型对照)、CD5、CD13、CD19、CD22、CD34、CD41、CD117、CD170、CyCD3、CyCD79a。阳性判断标准：淋系、髓系、干/祖细胞抗原阳性细胞≥20%，胞浆染色抗原阳性细胞≥10%。分型标准参照欧洲白血病免疫分型协作组的积分原则(EGIL)[10]。

1.6MLL基因重排检测[11]分离患儿初诊骨髓样本中的单个核细胞，根据Trizol试剂盒 (美国Life Technology公司)说明提取总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。采用随机逆转录引物 (美国Invitrogen公司)将2 μg RNA反转录为cDNA。采用巢式PCR扩增和6%丙烯酰胺凝胶电泳及银染色方法鉴定MLL基因重排是否存在及其类型。

1.7 Ig/TCR基因重排相关因素采集 参照我院急性淋巴细胞白血病2003(BCH-ALL-2003)和中国儿童白血病治疗协作组急性淋巴细胞白血病2008(CCLG-ALL-2008)方案分层标准[12]，本文采集可能影响祖B-ALL患儿Ig/TCR基因重排的临床和生物学因素：①性别；②年龄；③初诊外周血WBC计数；④MLL基因重排；⑤免疫表型分子标记。并采集可能受Ig/TCR基因重排影响的结局指标：①临床治疗危险度；②泼尼松反应；③诱导缓解治疗结束时(第33 d)MRD；④巩固治疗开始时(第78 d)MRD；⑤预后。

1.8 随访 入组患儿根据病历记录随访其是否发生复发和死亡，如无上述不良事件发生，则通过电话随访其预后情况，截止日期为2018年6月30日。无事件生存(EFS)观察时间为自诊断之日起至发生事件之日或研究随访截止日期。事件定义为死亡、复发或第二肿瘤。

1.9 统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行统计分析。采用精确概率法χ2检验比较阳性组与阴性组初诊临床特征，泼尼松反应及诱导缓解治疗结束时和巩固治疗开始前MRD的差异。生存率分析采用Kaplan-Meier法；Ig和TCR重排阳性组和阴性组间EFS的比较采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间符合本研究纳入标准的祖B-ALL初诊患儿40例，其中男25例(62.5%)；中位年龄4岁8个月(7个月至13岁3个月)。30例(75.0%)接受BCH-ALL-2003方案，10例(25.0%)接受CCLG-ALL-2008方案规范治疗。28例(70.0%)处于长期持续缓解状态，10例(25.0%)骨髓复发，2例(5.0%)中枢神经系统复发。

2.2 Ig和TCR基因重排检出率和克隆特性 40例祖B-ALL患儿均检测到至少1种Ig或TCR克隆性重排，其中37例(92.5%)检出Ig基因重排，29例(72.5%)检出TCR基因重排；26例(65.0%)同时检出Ig和TCR基因重排。表2显示，IgH基因重排检出率最高(90.0%)，单克隆重排率为52.8%，完全重排和不完全重排分别为31和11例，其中6例同时具有完全和不完全重排；其次为TRD基因重排(52.5%)，但其单克隆性重排比例为95.2%，重排类型主要为Vδ-Dδ和Dδ-Dδ不完全重排。IgK中VK-JK和VK-Kde/Intr-Kde重排发生率分别为20.0%和25.0%。TRB中完全重排和不完全重排比例分别为12.5%和7.5%，1例患儿同时具有上述两种重排。

表2 祖B-ALL患儿Ig和TCR基因重排检出率及克隆特性[n(%)]

2.3 Ig和TCR基因重排与临床和生物学特征的关系 表3显示，TRD基因重排阳性患儿白血病细胞表达CD22的频率显著低于TRD基因未重排者，分别为38.1%(8/21)和73.7%(14/19)，P=0.031。与阴性组相比，TRD重排阳性患儿高WBC的比例较高，IgK重排阳性患儿CD22表达阳性者比例较高，TRB重排阳性患儿伴有髓系或T系跨系标记的比例较高，14例MLL基因重排阳性患儿均未发生TRB基因重排。Ig和TCR基因重排与其他临床和生物学特征，以及泼尼松反应和MRD水平无相关性(表3)。

2.4 Ig和TCR重排与患儿预后的关系 40例祖B-ALL患儿随访中位时间为132(3～180)个月， 5年EFS为(72.4±7.1)%。各Ig和TCR基因克隆性重排均不与患儿预后相关(表4)。如表4和图1所示，IgH双/寡克隆重排亚组5年EFS显著低于IgH单克隆重排亚组，(58.8±12.3)%vs(84.2±8.4)%，P=0.044。其他标志因单克隆和双克隆/寡克隆重排检出的例数较少，未行统计学分析。

表3 祖B-ALL患儿Ig和TCR克隆性重排与临床生物学特征及预后的相关性(n)

表4 祖B-ALL患者Ig和TCR基因重排对EFS的影响

图1 祖B-ALL患儿IgH基因重排特性对预后的影响

3 讨论

欧洲白血病治疗协作组BIOMED-2研究显示，多重PCR检测可使Ig/TCR基因重排的检出率达到100%[9]。本研究采用该引物体系，结合异源双链分析和测序，40例祖B-ALL患儿均检测到至少1种克隆性Ig/TCR基因重排，提示这一方法适合于临床应用。

本研究祖B-ALL患儿IgH、VK-JK和IgL的检出率与文献报道的儿童B前体-ALL相似，但是VK-Kde/Intr-Kde和跨系表达的TRD、TRG、TRB的发生率均显著低于B前体-ALL，祖B-ALL患儿分别为25%、52.5%、30%和17.5%，B前体-ALL患儿分别为43%、71%、60%和34%[10]。此外，本研究祖B-ALL患儿IgH不完全重排DH-JH的发生率高于文献报道的B前体-ALL，完全重排VH-DH-JH则较低[13]。以上结果提示，免疫表型不同的BCP-ALL，其Ig和TCR基因重排类型也不同，免疫表型更不成熟的祖B-ALL，其免疫基因型也更不成熟。

正常的祖B细胞不表达CD19，前B-Ⅰ细胞已表达CD10；而祖B-ALL已表达CD19，尚未表达CD10，故其免疫表型对应的分化阶段在正常的祖B细胞和前B-Ⅰ之间。正常的Ig基因重排开始于前B-Ⅰ，先发生DH-JH基因重排，然后是VH-DH-JH，IgK和IgL重排发生在前B-Ⅱ阶段。本研究结果显示，祖B-ALL患儿IgH、IgK和IgL重排的发生率分别为90%、32.5%和10%，提示祖B-ALL的免疫基因型不能完全反映其对应阶段正常B细胞的免疫基因型，导致这一现象的原因可能是祖B-ALL细胞丢失了对功能性重排的正确选择和重组酶系统的持续激活[14]。此外，由于白血病细胞中的重组酶持续激活，还可能导致诊断后发生克隆演化。

本研究祖B-ALL患儿跨系TCR基因重排的比例为72.5%，与Meleshko等[15]在儿童BCP-ALL中报道的80%相近。在正常T淋巴细胞中，TCR基因重排发生的先后顺序为TRD、TRG和TRB，而研究显示存在于BCP-ALL中的TCR重排在正常的B前体细胞也存在，可能是白血病细胞中的生理性重组，且这一重组的生理顺序又比较保守[16]。本研究结果显示，祖B-ALL中TRD、TRG和TRB重排的发生率逐渐降低，依次为52.5%、30%和17.5%，这与祖B细胞分化阻滞于最不成熟的B淋巴细胞阶段相吻合，同时也提示，同为相同免疫表型的祖B-ALL，其白血病细胞的分化时期仍有差异，发生TRD重排的白血病细胞阻滞阶段可能早于TRB重排者。

既往儿童BCP-ALL中的研究显示，与3～10岁患儿相比，<3岁或>10岁患儿DH-JH的比例较高，IgK、TRG和TRD重排发生的比例较低，而产生这一年龄差异的原因在于，<3岁患儿祖B-ALL的比例较高，而祖B-ALL的不完全IgH重排发生率高，完全重排的比例低；且少有IgK、TRG和TRD重排[6]。但是，其他的研究并未发现BCP-ALL患儿年龄与Ig和TCR重排的相关性[17]。本研究祖B-ALL患儿无论按照1～10岁，还是参照文献3～10岁进行分类(各标志重排阳性与阴性患儿P值均差异无统计学意义，结果未在本文显示)，均未发现年龄与基因重排的相关性，提示影响重排类型的因素在于免疫表型等生物学因素，而与年龄相关性不大。此外，本研究发现，B细胞分化标志CD22的表达与基因重排具有相关性，CD22阳性患儿TRD基因重排的发生率显著低于阴性患儿，而IgK基因重排的比例高于阴性患儿，提示发生TRD基因重排的祖B白血病细胞分化阻滞发生的时期较早。

多个研究均证实Ig和TCR基因重排与特定的融合基因具有相关性。Hubner等[18]研究显示，TEL-AML1+白血病Ig和TCR重排的发生率较高，且重排模式独特；Alexander等[15]研究显示，E2A-PBX1阳性患儿很少发生TRG基因重排。本研究祖B-ALL患儿中，MLL基因重排的比例较高(14/40，35%)，且14例MLL重排阳性患儿均未见TRB基因重排，提示MLL重排阳性患儿白血病细胞阻滞的阶段可能更早。Jansen等[13]在婴儿ALL中的研究显示，MLL-AF4和MLL-ENL阳性患儿Ig和TCR表现为不成熟的重排形式，而MLL-AF9阳性者则主要是成熟的重排形式。

本研究并未发现Ig或TCR基因重排与祖B-ALL患儿的预后相关，但发现IgH双/寡克隆患儿预后差于单克隆患儿，这与Green等[8]在儿童B前体ALL中报道的结果一致，即寡克隆/亚克隆患儿的复发率高达65%，5年EFS比单克隆患儿低40%。双/寡克隆的白血病细胞来源于不同分化时期，形成2个或以上克隆，在儿童B-ALL中的发生率较高[19,20]，IgH不完全重排为30%～40%，完全重排可达50%～60%，其预后差于单克隆重排患者，提示双/寡克隆重排的恶性克隆更不稳定。

本研究通过多重PCR结合异源双链和测序的方法，对祖B-ALL患儿Ig/TCR基因重排特点进行了分析，发现其与患儿临床和生物学特征具有相关性，且IgH双/寡克隆性重排患儿预后不良，从而为祖B-ALL患儿的诊断治疗及预后提供了重要信息。