基于H1R、PAR-2/TRPV1痒信号通路探讨马齿苋对急性湿疹的干预作用①

葛一漫 胡一梅 王 毅 马 韬 张灵玲 雍江堰 张朝明

(成都中医药大学附属医院，成都 610075)

急性湿疹(Atopic eczema，AE)是一类临床上常见的皮肤病，瘙痒是急性湿疹的最基本的临床特征，更是判断病情的主要依据。产生瘙痒的信号通路主要有两条，即组胺依赖的信号通路和非组胺依赖信号通路，其中TRPV1是这两条通路共同的下游信号，是瘙痒产生的关键分子。

本实验拟通过运用马齿苋提取液治疗急性湿疹大鼠，观察大鼠皮肤的湿疹严重程度，结合造模区H1R、PAR-2和TRPV1的表达及细胞内Ca2+浓度，对比组胺依赖的痒信号通路和非组胺依赖的PAR-2途径，探讨马齿苋提取液控制急性湿疹瘙痒症状的可能机制及其信号传导途径。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SD大鼠，雌雄不限，体重180～220 g[成都达硕生物科技有限公司，实验动物合格证号:SCXK(111)2008-24]。实验室温度保持在(24±2)℃，相对湿度保持在40%～70%，严格按照12 h/12 h明暗交替光照。

1.1.2药物与试剂 马齿苋提取液(采用去根马齿苋鲜草榨汁获得)； DNCB购自成都科龙化工试剂厂(批号：20090813)；一抗H1R(克隆号：bs-663R)、PAR-2(克隆号：bs-1178R)、TRPV1(克隆号：bs-1931R)均购自北京博奥森生物技术有限公司；二抗及相应试剂盒及阳性片购自北京中山金桥生物有限公司；病理图像分析系统(Image-Pro Plus6.0，麦克奥迪实业集团有限公司)

1.2方法

1.2.1实验分组及造模 大鼠30只，随机分为正常组、模型组、马齿苋组，每组10只。大鼠腹部采用5%DNCB 30 μl进行首次致敏，之后每隔2 d，对大鼠右背部采用0.2%DNCB 50 μl进行二次抗原攻击3次。第9天观察大鼠造模区是否出现湿疹症状。第10天起各组大鼠分别给予相应药物进行治疗，连续9 d。所有实验均根据赫尔辛基宣言和保护及运用动物的指导原则进行。

1.2.2实验取材 断颈处死动物，取大鼠造模区皮肤一块，10%中性甲醛溶液中固定48 h，待做免疫组化检查。

1.2.3观察指标

1.2.3.1一般情况观察及湿疹面积及严重度指数(Eczema area and severity index,EASI)评分 具体方法参见《湿疹面积及严重度指数评分法》[1]。

1.2.3.2免疫组化染色各组大鼠皮肤H1R、PAR-2、TRPV1及其含量的测定 取固定后的大鼠皮肤组织，进行洗涤、脱水、包埋、切片、加一抗、加二抗，封片后显微镜下观察H1R、PAR-2、TRPV1免疫组化染色切片，首先在低倍(×100)下观察阳性物质分布、范围及位置，选择阳性物质最明显处(“热点”)5个视野，然后在中倍(×200)下，采用Image-Pro Plus图像分析系统(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量检测上述5个视野阳性物质的积分光密度(IOD)，计算平均IOD，表示H1R、PAR-2、TRPV1含量。

1.2.3.3细胞内Ca2+浓度测定 采用流式细胞仪，激发波长488 nm。随机测定单个细胞的荧光强度值，取2×104个细胞的荧光强度值的平均值为每份样品Ca2+浓度的测定值。并按以下公式计算出各组Ca2+浓度：[Ca2+]=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)。式中Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数；F为不同条件下测定的平均荧光强度值。

2 结果

2.1各实验组EASI的检测结果[1]由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠EASI均有显著增高(P<0.01)；与模型组比较，马齿苋组大鼠EASI均有显著减小(P<0.01)。

2.2各组大鼠皮肤组织H1R、PAR-2和TRPV1观察检测结果 由图1、表2可知，与正常组比较，模型组H1R(P<0.05)、PAR-2(P<0.01)明显增加，TRPV1含量有所增加，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，马齿苋组H1R、PAR-2明显减少(P<0.01)，TRPV1含量有所减少，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3对KC内Ca2+浓度的影响 由表3可知，与正常组比，KC内Ca2+浓度显著增加(P<0.01)；与模型组比，KC内Ca2+浓度均显著减少(P<0.05)。

GroupsEASI[1]Normalcontrol0 00±0 00Model14 24±2 231)Portulacaextracts1 92±0 242)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01.

GroupsnH1RPAR⁃2TRPV1Normalcontrol100 1572±0 00380 1534±0 00220 1606±0 0121Model100 1695±0 00912)0 1708±0 01151)0 1682±0 0133Portulacaextracts100 1604±0 01213)0 1541±0 00683)0 1620±0 0057

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model group,3)P<0.01.

图1 皮肤组织中H1R、PAR-2、TRPV1的表达(免疫组化染色，×200)Fig.1 Expression of H1R，PAR-2 and TRPV1 in skin tissue(immunohistochemical staining,×200)

GroupsnCa2+(μmol/L)Normalcontrol100 75±0 13Model103 49±0 411)Portulacaextracts101 16±0 152)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05.

3 讨论

急性湿疹所致的皮肤瘙痒常由内、外源性化学物质介导，多条信号通路共同传递。目前认为，皮肤瘙痒的发生主要通过两个途径：组胺依赖的痒信号通路、非组胺依赖的PAR-2途径[2]。两条信号通路的共同下游信号分子是TRPV1，是痒觉通路传递的枢纽。TRPV1主要对Ca2+具有通透性，通过介导Ca2+的跨膜流动及细胞器中Ca2+的释放提供通道，改变细胞内Ca2+浓度[3-5]。马齿苋，早在《本草纲目》中就有记载，具有清火解湿、泻热祛腐等功效，主治恶疮、疔疮肿毒、风结疮丹毒和秃疮湿癣等。现代研究发现[6]，马齿苋主要含有不饱和脂肪酸类、黄酮类、生物碱类、挥发油等活性成分，具有消炎抑菌、增强免疫的作用，用于治疗湿疹、瘙痒症等风热、湿热类的皮肤病，疗效显著。

组胺依赖的痒信号通路可由组胺激活，通过一类机械刺激不敏感的无髓鞘C-纤维(Mechanically-insensitive C-fibers，CMi)介导。在真皮和表皮的分界处存在传入神经纤维亚单位。在Ca2+存在条件下，H1R首先激活磷脂酶C(Phospholipase C ，PLC)和磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA-2)，再活化下游TRPV1通道，增加Ca2+内流[7,8]；同时，PLC可发生水解，其产物二酰基甘油(Diacylglycerol，DAG)直接开放TRPV1通道[9]，诱导产生痒觉。PAR-2途径由一类机械刺激热敏感的C-纤维介导。类胰蛋白酶是PAR-2的有效激活剂。类胰蛋白酶首先激活 PAR-2，PAR-2的激活促使PLC活化，PLC进一步增加下游蛋白激酶C的表达，最后使下游TRPV1通道开放，增加Ca2+内流；同时，PAR-2可以通过激活蛋白激酶 A，增加 TRPV1 活性[10]，诱导产生痒觉。

我们前期实验证明马齿苋对急性湿疹有较显著的治疗作用[11]。本实验结果提示，与正常组比较，模型组急性湿疹大鼠皮肤H1R、 PAR-2含量以及KC内Ca2+浓度显著增多，TRPV1有所增高，但无显著性差异，结果提示大鼠急性湿疹的形成特别是瘙痒的产生是通过组胺信号通路与非组胺信号通路共同发挥作用，但TRPV1含量没有显著增高，推测其作用机制是通过激活H1R和PAR-2，进一步激活TRPV1通道，增强TRPV1活性，导致细胞内Ca2+浓度增高，产生瘙痒，这与Kim[9]、Reddy[10]等报道一致；用药后，与模型组比，马齿苋组 H1R 、PAR-2含量以及KC内Ca2+浓度显著减低，TRPV1有所减少，但无显著性差异，结果提示，马齿苋的抗瘙痒的作用是通过组胺信号通路与非组胺信号通路发挥作用，推测其机制是通过抑制H1R 和PAR-2，进一步抑制TRPV1通道，降低其活性，导致Ca2+浓度减少，控制瘙痒。但马齿苋提取液调控TRPV1通道开放及对TRPV1活性的影响机制还有待进一步实验研究。

本实验还发现，模型组中PAR-2表达的增加高于H1R，用药后，马齿苋对PAR-2的抑制作用也比H1R更为明显，推测在急性湿疹产生的瘙痒信号通路中，PAR-2途径比组胺依赖的信号通路作用更大，但其具体的机制还有待进一步的研究。

综述所述，大鼠急性湿疹特别是瘙痒的产生及马齿苋提取液对其治疗的作用机制可能是通过组胺依赖性信号通路和非组胺依赖信号实现的。TRPV1是上述两条通路的共同下游信号分子，TRPV1数量改变、活性状态改变，与急性湿疹特别是瘙痒的产生、消退显著相关。本实验结果支持，TRPV1活化可导致急性湿疹瘙痒，马齿苋则是通过降低TRPV1活性状态发挥治疗急性湿疹瘙痒的作用。

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