吉西他滨PLGA纳米颗粒对小鼠Lewis肺癌细胞增殖抑制效应的实验研究①

乌 兰 郑源强 陈 哲 贾宇臣 丁 枫 崔正荣 石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特 010058)

肺癌是患病率极高的肿瘤，其死亡率在所有肿瘤种类中的上升比率最大，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一[1]。目前化疗仍是治疗肺癌的重要措施。吉西他滨为肺癌治疗的一线药物，但它亲水性强，分子量小，血浆半衰期短仅17 min，常规化疗时其在瘤体内难以达到有效的作用浓度，而提高化疗药物的剂量则易导致不良反应增加并产生耐药。聚乙酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是无毒的生物降解性聚合物，该聚合物在体内生物相容性好，可用于药物缓释制剂载体。与传统药物剂型相比，纳米颗粒具有药物缓释和定向释放的优势，可明显增加靶器官病灶部位的药物浓度，提高药物的生物利用度，减轻药物对非靶向部位的毒性，减少全身不良反应的发生。本研究将GemC18-PLGA-NPs应用于LLC细胞并检测其对细胞体外增殖抑制效应和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1纳米颗粒和药品 GemC18-PLGA-NPs、PLGA-NPs、GemC18由美国德州大学奥斯汀分校药学院崔正荣教授实验室制备[2，3]。GemC18-PLGA-NPs 纳米粒径为(212±20)nm，Zeta 电位(-42.4±12)mV，多分散指数<0.2。Gemcitabine HCl(GemHCl)购自Biotang公司。

1.1.2细胞株、主要试剂和仪器 小鼠肺癌细胞(LLC)购自中国科学院细胞库，四甲基偶氮蓝(MTT)购自Amresco公司，DMEM、FBS、双抗溶液均为以色列BI公司产品，AnnexinV-FITC/Propidium Iodide(PI)凋亡检测试剂盒购自BD公司，酶标仪为Molecular Devices SpectraMax i3，细胞培养箱为Thermo 371,流式细胞仪BD FACSCalibur。

1.2方法

1.2.1细胞体外生长抑制实验

1.2.1.1共分为4组 GemC18-PLGA-NPs组、GemC18组、GemHCl组和PLGA-NPs组。

1.2.1.2设置6个药物浓度(按所含Gemcitabine计算)：0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L。流式细胞术检测的药物浓度为0.1 μmol/L。

1.2.1.3观察时间 MTT法给药后，分别在24、48、72 h进行检验。流式细胞术在给药后48、72 h进行检验。

1.2.1.4细胞培养 将细胞培养在DMEM培养液中(含10%FBS，100 U/ml青霉素和链霉素)，置于含5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中。

1.2.2MTT法检测给药后各组IC50值和细胞存活率(SR) 细胞经0.25%胰酶消化后，取混悬细胞液，以5×103/孔，按每孔180 μl接种于96孔板，每组药物设置5个复孔，继续培养24 h，待细胞贴壁后给药。给药后继续培养24、48、72 h，每孔于结束培养前加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl，轻轻震荡，10 min后在570 nm波长处用酶标仪检测光密度(OD)值。细胞存活率SR=(给药组OD值-无药组OD值)/(对照组OD值-无药组OD值)×100%。

1.2.3流式细胞仪检测不同给药组对Lewis细胞的凋亡作用 细胞消化后，取混悬细胞液，以2×105/孔，每孔3 ml的浓度接种于6孔板培养，培养板设置4个复孔。在接种6孔板之前，用培养液润湿一下，以免加入细胞不均匀，每加两个孔混匀一下。放入5%CO2，37℃培养箱进行培养，待24 h后细胞贴壁给药，用0.1 μmol/L的药物处理细胞。给药后继续孵育48和72 h，收集细胞，进行检测。取出6孔板，消化，离心弃上清。用预冷的PBS洗涤3次，重悬细胞，调整细胞浓度为1×106ml-1。加入100 μl Annexin Ⅴ Binding Buffer，混匀并重悬细胞，用10 μl AnnexinⅤ FITC和10 μl PI，轻轻混匀。25℃避光染色15 min，漩涡混匀。每管加入400 μl AnnexinⅤ Bingding Buffer，混悬后进行过滤，过滤后1 h内检测。用流式细胞仪检测细胞凋亡率，以百分率表示。

1.3统计学分析 采用Graphpad5.0计算软件，计算IC50值及细胞存活率，进行统计，对组间差异采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1吉西他滨GemC18-PLGA-NPs对Lewis肺癌细胞体外增殖抑制作用 MTT法检测各给药组IC50值及细胞存活率(SR)，各组检测结果见图1，在24、48 h时GemC18-PLGA-NPs组的IC50值均高于GemHCl组(P<0.05)，GemC18-PLGA-NPs组与GemC18组在24、48 h的IC50值存在差异(P<0.05)，在72 h无组间差异。GemC18与Gem-HCl在24 h的IC50值存在差异(P<0.05)，在48、72 h无明显差异(P>0.05)。

图1 给药24、48、72 h后各组药物对LLC细胞的增殖抑制作用(IC50值)Fig.1 IC50 values of different groups after 24,48，72 hNote: *.P<0.05,compared to GemHCl;#.P<0.05,compared to GemC18.

给药后24 h，在0.000 1、0.001 μmol/L两个浓度点GemC18-PLGA-NPs组与GemC18和GemHCl组的SR无组间差异 (P>0.05)。 在0.01、 0.1、1、10 μmol/L浓度处GemC18-PLGA-NPs的SR明显高于GemC18和GemHCl组(P<0.05)。GemC18组在0.000 1、0.001、0.01 μmol/L浓度处与GemHCl组无明显组间差异(P>0.05)，在0.1、1、10 μmol/L浓度处，两组间存在差异(P<0.05)，见图2。

给药48 h后，GemC18-PLGA-NPs在各个浓度的SR均高于GemHCl组，GemC18-PLGA-NPs与GemHCl组均存在显著的组间差异(P<0.05)，GemC18-PLGA-NPs与GemC18组在浓度0.000 1、0.001、10 μmol/L处无明显组间差异(P>0.05)，在浓度0.01、0.1、1 μmol/L处存在组间差异(P<0.05)。GemC18组与GemHCl组在浓度10 μmol/L无组间差异(P>0.05)，GemC18组在浓度0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L的SR均高于GemHCl组，存在明显组间差异(P<0.05)，见图3。

给药72 h后，GemC18-PLGA-NPs组与GemC18组和GemHCl组在0.000 1、0.001、10 μmol/L浓度处的SR无组间差异(P>0.05)，在0.01、0.1、1 μmol/L浓度处的SR均高于GemC18组和GemHCl组存在组间差异(P<0.05)。GemC18与GemHCl在0.000 1、0.001、1、10 μmol/L浓度无组间差异(P>0.05)，在0.01、0.1 μmol/L浓度处存在组间差异(P<0.05)。PLGA-NPs组的SR在24、48和72 h的每个浓度点均在80%以上，大于其他给药组的SR，见图4。

2.2细胞存活率的浓度和时间依赖性 图2结果提示：(1)给药后24、48、72 h，GemC18-PLGA-NPs、GemC18、GemHCl组的SR与给药浓度均呈负相关，但GemHCl组在1 μmol/L后似已进入平台期，而GemC18-PLGA-NPs组的SR曲线仍下降明显。PLGA-NPs组的存活率并无浓度依赖性。(2)GemC18-PLGA-NPs、GemC18和GemHCl组的SR均具有明显的时间依赖性(P<0.05)，PLGA-NPs组的存活率不具有明显的时间依赖性(P>0.05)。实验结果显示GemC18-PLGA-NPs对LLC细胞有一定的时间延续性，表明药物具有一定的缓释作用。

图2 药物作用24、48、72 h后细胞存活率(MTT法)Fig.2 SR of different groups after 24,48,72 h(MTT method)Note: *.P<0.05,compared to GemHCl;#.P<0.05,comared to GemC18.

图3 药物作用48 h和72 h后各组细胞凋亡率(FACS)Fig.3 Apoptosis of different groups after 48 h or 72 h by FACS

Groups48h72hControl29 83±0 9633 86±8 37PLGA⁃NPs31 24±3 5638 88±3 17GemHCl94 44±1 6796 88±1 49GemC1873 00±11 301)87 30±3 311)GemC18⁃PLGA⁃NPs56 92±4 431)2)68 05±2 701)2)

Note：1)P<0.05,compared to GemHCl;2)P<0.05,compared to GemC18.

2.3不同药物组的细胞凋亡率 给药后48、72 h，GemC18组和GemC18-PLGA-NPs组与GemHCl组的细胞凋亡率相比均存在显著统计学差异(P<0.05)，72 h，GemC18与GemHCl组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。GemC18与GemC18-PLGA-NPs相比差异具有统计学意义(P<0.05)。PLGA-NPs组与Control组相比差异无统计学意义，PLGA-NPs组对细胞的凋亡无明显影响。见图3、表1。

3 讨论

吉西他滨是脱氧胞苷的水溶性类似物，主要通过竞争性抑制DNA合成的相关酶而阻止细胞的分裂和增殖，最终导致肿瘤细胞死亡。被批准用于治疗胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤[2]。然而，吉西他滨存在几个缺点，例如静脉注射后被胞嘧啶脱氨酶快速脱氨基转变为无活性的2′-2′-二氟脱氧尿苷，使其失去了抗肿瘤作用，吉西他滨因核糖核苷酶还原酶M1亚型(RRM1)过表达而产生耐药[3,4]，半衰期短、毒性强等。在吉西他滨分子基团的N4位引入硬脂酰基，形成的前药4-(N)-stearoylgemcitabine(GemC18)对血浆脱氨酶不敏感，可以保护吉西他滨免受脱氨酶的脱氨作用，提高了吉西他滨的代谢稳定性[5,6]。GemC18是吉西他滨的脂肪酸酰胺前药，经酰胺酶水解后可释放母体药物吉西他滨，延长了吉西他滨的半衰期。吉西他滨的酰胺衍生物GemC18在肿瘤细胞内释放出吉西他滨，向其他组织扩散减少，减轻了局部毒性，细胞内药物蓄积增加，抗肿瘤活性增加。PLGA是FDA批准的可生物降解和生物相容的聚合物，降解产物乳酸和羟基乙酸可参与人体的新陈代谢，最终生成二氧化碳和水排出体外[7]。PLGA颗粒可用作GemC18载体。在延长体内循环时间，增加在肿瘤组织的药物分布，达到靶向治疗肿瘤的目的等方面有重要作用[8]。PLGA可通过改变形成的颗粒大小而调节由PLGA制备的颗粒的药物释放速率[8-10]。

本实验采用了MTT法检测了GemC18-PLGA-NPs、GemC18和GemHCl对Lewis肺癌细胞株的体外增殖抑制作用，结果显示：(1)GemC18-PLGA-NPs和GemC18在制备过程中并无吉西他滨药效的减损，仍然具有显著的细胞抑制作用；(2)72 h后，GemHCl似在1 μmol/L浓度处已进入平台期，而GemC18-PLGA-NPs的曲线继续下降，说明GemC18-PLGA-NPs可伴随着浓度的加大而增强对肿瘤细胞的抑制作用，并具有时间延续性；(3)PLGA-NPs组没有明显的增殖抑制作用，细胞存活率均在80%以上，也没有明显的时间及浓度相关性，提示PLGA纳米颗粒具有良好的生物相容性，有广泛的临床应用前景。

关于实验结果涉及的几点问题：(1)被吞噬功能：由于GemHCl具有很强的水溶性，其进入细胞依赖细胞膜的核苷转运蛋白[8]；而GemC18-PLGA-NPs可以通过先释放出GemC18再释放出GemHCl然后进入细胞的途径，也可通过纳米颗粒被细胞整体吞噬的途径进入；因此在细胞膜的核苷转运蛋白达到饱和以后仍可以进入肿瘤细胞。这可能是GemHCl在1 μmol/L浓度以后药物作用不再随着浓度增加而增大，而GemC18-PLGA-NPs对肿瘤细胞存活率仍然继续下降的主要原因。(2)缓释功能：GemC18-PLGA-NPs在72 h后，10 μmol/L浓度处细胞具有较低的存活率，在1 μmol/L浓度以后具有存活率-浓度负相关，这种现象可能与纳米颗粒的缓释作用有关。GemC18-PLGA-NPs可以通过药物的缓释作用避免细胞膜转运蛋白的过饱和，也可避免因血浆酰胺酶的水解作用而使药物失去活性。GemC18-PLGA-NPs可通过胞吞作用进入肿瘤细胞内遵循先释放GemC18，再释放出GemHCl的迟缓过程，具体表现为给药后72 h的细胞存活率低于给药后24 h和48 h。

由于体内外环境的差异极大，本实验仅初步检测GemC18-PLGA-NPs对LLC细胞的体外增殖抑制作用和对细胞凋亡的影响，尚难以体现其更多的药物缓释优势，后续仍需进行Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠模型等体内实验以进一步证实。

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