下调HIF-2α基因对低氧诱导的肝癌细胞体外生物学行为的影响

李伟伟 耿晓松 申保生 杨玉新 宋新文

(新乡医学院第一附属医院感染疾病科，卫辉 453100)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤，发病率位居所有肿瘤的第五位，死亡率位居第三位[1]。侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因[2]。因此，明确肿瘤侵袭及转移的关键调控基因及其相应的信号通路，并进行相应的阻断是肿瘤治疗的重要措施[3]。在肿瘤的发展过程中，因自身血管供应不能满足快速生长的肿瘤细胞的需要，逐渐形成低氧环境，肿瘤细胞能通过一系列自我调节以适应低氧微环境，其中发挥核心调控作用的因子为HIF-2α[4，5]，激活后启动下游多种基因和蛋白质的表达，参与细胞增殖、代谢、血管生成、肿瘤浸润转移等，加速疾病恶化[6]。因此，本实验应用特异性HIF-2α siRNA下调低氧诱导下人肝癌细胞株HepG2细胞中HIF-2α表达，研究其表达下调对低氧环境下的HepG2细胞体外增殖、凋亡和迁移侵袭等生物学行为的影响，为肝癌的分子靶向治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 RT-PCR 试剂盒、LipofectamineTM2000和Trizol Reageat购自美国Invitrogen公司；CoCl2购自美国Sigma公司；HIF-2α引物由上海生工生物工程有限公司合成，特异性siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成，兔抗人HIF-2α单克隆抗体为美国Santa Cruz 公司产品；BCA蛋白定量试剂盒、增强化学发光(ECL)显色液购自中国南京凯基生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司。

1.1.2细胞 人肝癌细胞株HepG2由中国科学院上海细胞库提供。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养、诱导低氧环境 肝癌HepG2细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(37℃培养箱、5%CO2)培养，胰酶消化传代。取24孔板接种对数生长期细胞1×104个/孔，继续培养24 h后，培养基分别调换成CoCl2浓度为50、100、200、400 μmol/L的缺氧培养箱，诱导HepG2细胞处于低氧环境，继续培养24 h后收集细胞用于检测。

1.2.2不同低氧浓度诱导下HepG2细胞HIF-2α mRNA表达 收集各组HepG2细胞，按照Trizol RNA试剂盒说明书步骤操作，逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板，以荧光定量PCR的方法扩增HIF-2α mRNA，Real-time PCR方法检测各组细胞中HIF-2α mRNA表达。HIF-2α引物序列：上游5′-GGTGAAAGTCTACAACAACTGCC-3′，下游5′-ATGGGTGCTGGATTGGTTC-3′，GAPDH引物序列：上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。Real-time PCR 扩增条件：95℃预变性5 min、95℃变性30 s、60℃退火30 s 和 72℃延伸30 s，共 40 个循环。所有标本均重复检测3次，计算Ct值，采用2-ΔΔCt法进行计算分析。

1.2.3细胞转染及分组 选择合适低氧浓度(加200 μmol/L CoCl2)诱导细胞后，在RPMI1640培养液中(37℃培养箱、5%CO2)培养，细胞融合度达到85%左右时，在LipofectamineTM2000脂质体介导下转染细胞。实验分为四组，常氧组、低氧组、低氧+Control siRNA组、低氧+HIF-2α siRNA组。

1.2.4转染后HepG2细胞HIF-2α mRNA表达 收集转染后48 h的各组HepG2细胞，按照1.2.2步骤检测HIF-2α mRNA表达。

1.2.5转染后HepG2细胞HIF-2α蛋白表达 收集转染后各组细胞分别进行培养，48 h后提取各组核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。10%的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，电泳后转印至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST于常温下封闭1 h，分别加入GAPDH和HIF-2α一抗，4℃孵育过夜。次日洗膜后，加入对应的第二抗体孵育90 min，加入ECL显色液显影。采用Quantity One软件，对图片进行分析并测定灰度值。

1.2.6转染后HepG2细胞增殖变化 取对数生长期HepG2细胞，接种96孔板，接种细胞数量为：1×104个/孔，37℃、5%CO2培养24 h后，在培养基中加入200 μmol/L CoCl2并进行转染，每组设4个复孔，同时设空白对照。继续培养24、48、72、96、120 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液 20 μl继续培养4 h，弃去孔内上清液，加入150 μl/孔二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min后，以空白孔为对照，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，检测波长为490 nm，实验重复3次。记录结果，根据公式计算：细胞增殖率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%，绘制细胞生长曲线图。

1.2.7转染后HepG2细胞凋亡变化 收集转染48 h 后的各组 HepG2细胞，4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，250 μl 1×缓冲液重悬细胞制备单细胞悬液，调节浓度为1×106个/孔。取100 μl细胞悬液5 ml于流式管中，分别加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI混匀，室温避光孵育20 min，加入400 μl PBS，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3 次，取平均值。

1.2.8转染后HepG2细胞周期变化 细胞转染48 h 后，用不含EDTA的胰蛋白酶收集，磷酸盐缓冲液(PBS)制备成单细胞悬液，800 r/min离心10 min，70%乙醇4℃固定过夜，预冷的PBS洗涤3次，加入200 μl RNase A(1 mg/ml)，37℃温育30 min。避光条件下加入PI染色液(100 ng/ml)800 μl 混匀，4℃放置30 min。使用流式细胞仪分析样品，测定细胞周期。

1.2.9转染后HepG2细胞侵袭迁移力变化 Transwell法检测细胞迁移：采用24孔板Transwell迁移系统以无血清的DMEM培养基悬浮各组细胞为单细胞悬液(7.5×105个/ml)。在Transwell小室上层加入200 μl悬液，小室下层加入600 μl DMEM培养液(含10%胎牛血清)，常规培养24 h，取出小室，甲醇固定 30 min，苏木素染色 5 min，流水冲洗，棉签擦掉未穿过膜的细胞。光镜下随机选取6个视野计数，实验重复3次。Transwell法检测细胞侵袭：Transwell 小室滤膜上室面均匀涂Matrigel胶，紫外线照射杀菌。余下步骤同 Transwell迁移实验。

2 结果

2.1不同低氧浓度诱导下HepG2细胞HIF-2α mRNA表达 RT-PCR结果显示 HepG2细胞在常氧环境下有少量HIF-2α表达，当CoCl2浓度为50、100、200、400 μmol/L 时，HIF-2α mRNA相对表达量逐渐递增，与常氧组比较，均有显著性差异(P<0.05)。CoCl2浓度为200 μmol/L和 400 μmol/L时，HIF-2α mRNA表达量无显著性差异，因HepG2细胞在200 μmol/L CoCl2浓度时损伤相对轻，故后续实验选择200 μmol/L CoCl2作为低氧环境诱导HepG2细胞，见图1。

图1 不同浓度CoCl2组HepG2细胞HIF-2α mRNA的表达Fig.1 HIF-2α mRNA expression of HepG2 cells in different concentration of CoCl2 groupNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05.

2.2转染48 h后各组HepG2细胞中HIF-2α mRNA表达 低氧诱导下，HIF-2α mRNA表达显著上调，特异性转染HIF-2α siRNA后，HIF-2α mRNA表达显著下调，差异均有统计学意义(P<0.05)，低氧组与低氧+Control siRNA组相比，及低氧+HIF-2α siRNA组与常氧组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3转染48 h后各组HepG2细胞中HIF-2α蛋白表达 低氧诱导下，HIF-2α蛋白表达显著上调，特异性转染HIF-2α siRNA后，HIF-2α蛋白表达显著下调，差异均有统计学意义(P<0.05)，低氧组与低氧+Control siRNA组相比，及低氧+HIF-2α siRNA组与常氧组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图2 转染48 h后各组细胞中HIF-2α mRNA的表达Fig.2 Expression of HIF-2α mRNA in each group cell after 48 h transfectionNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

图3 转染48 h后各组细胞中HIF-2α蛋白的表达情况Fig.3 Expression of HIF-2α protein in each group cell after 48 h transfectionNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.1.Normoxic group;2.Hypoxia group;3.Hypoxia+control group;4.Hypoxia+HIF-2α siRNA group.

GroupsApoptosisrate(%)G0/G1phase(%)Sphase(%)G2/Mphase(%)Normoxicgroup9 862±0 62160 257±5 63520 807±1 69718 937±4 689Hypoxiagroup6 840±0 7861)46 108±4 5561)26 048±3 5581)27 843±3 1931)Hypoxia+controlgroup7 118±0 84244 795±4 21525 440±3 23829 765±3 919Hypoxia+HIF⁃2αsiRNAgroup10 663±0 6932)60 645±4 1992)21 168±2 0072)18 187±5 5002)F40 64520 5606 09011 008

Note：Compared with normoxic group,1)P<0.05;compared with hypoxia+control group,2)P<0.05.

图4 各组HepG2细胞生长曲线图Fig.4 HepG2 cell growth curve drawn by MTT methodNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

图5 转染48 h后各组细胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rate in each group cell after 48 h transfection

2.4MTT结果 低氧诱导下，HepG2细胞在24、48、72、96、120 h光密度值均显著升高，特异性转染HIF-2α siRNA后，HepG2细胞在对应时间点的光密度值均显著降低(P<0.05)，低氧组与低氧+Control siRNA组相比，及低氧+HIF-2α siRNA组与常氧组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图6 Transwell小室检测各组HepG2细胞的迁移、侵袭结果Fig.6 Migration and invasion of HepG2 cells were detected by Transwell cellsNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

2.5细胞凋亡及细胞周期分布 低氧诱导下，HepG2细胞凋亡率减少，特异性转染HIF-2α siRNA后，HepG2细胞凋亡率升高(P<0.05)，分布于G0/G1期细胞比率显著升高，S期及G2/M期细胞比率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，低氧组与低氧+Control siRNA组相比，及低氧+HIF-2α siRNA组与常氧组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5、表1。

2.6细胞侵袭迁移力 低氧诱导下，HepG2细胞侵袭迁移数目增多，特异性转染HIF-2α siRNA后，HepG2细胞迁移力降低，穿过侵袭膜的细胞总数减少(P<0.05)，低氧组与低氧+Control siRNA组相比，及低氧+HIF-2α siRNA组与常氧组相比，差异无统计学意义(均P>0.05)，见图6。

3 讨论

由于恶性肿瘤生长过快，同时微血管结构异常不能提供充足的氧，导致肿瘤组织存在缺血缺氧区[7]。在肿瘤的长期慢性缺氧过程中，发挥主要作用的调控因子为HIF-2α，通过启动其下游靶基因，增加肿瘤的恶性生物学行为[8-10]。因此，本实验应用特异性HIF-2α siRNA转染低氧环境下HepG2细胞，探讨下调HIF-2α基因对人肝癌细胞株HepG2低氧状态下增殖、凋亡、细胞周期分布和迁移侵袭力的影响。

目前国内实验室多采用在培养基中加入不同浓度CoCl2的方法来诱导肿瘤细胞体外低氧。通过实验，我们发现200 μmol/L的CoCl2作用细胞，可达到理想的低氧状态，同时对细胞的损伤也较轻。RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是近年来在基因治疗研究领域兴起的一项新技术，与传统的反义寡核苷酸和核酶等基因沉默手段相比，稳定性更好，抑制效果更优越[11]。实验中，我们发现低氧环境下HepG2细胞HIF-2α mRNA和蛋白表达水平均显著升高，特异性HIF-2α siRNA转染细胞48 h后，HIF-2α在mRNA及蛋白水平表达均显著下调，说明细胞转染成功。

肿瘤的进展离不开肿瘤细胞的过度增殖和凋亡减弱[12]，并与细胞周期的调控异常有密切关系。细胞周期遵循G1-S-G2-M的发展规律，细胞一旦从G1期跨入S期则不再依靠外来信息刺激而自动完成分裂过程[13,14]。低氧环境下，肝癌HepG2细胞生长速度加快，处于合成后期的细胞比率明显增多，细胞凋亡减少，特异性HIF-2α siRNA转染后，HepG2细胞生长速度减慢，增殖能力下降，处于合成前期(G0/G1期)的细胞比率升高，细胞凋亡增加。这表明特异性HIF-2α siRNA 很可能通过调控其细胞周期来控制肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡。侵袭和转移是影响肿瘤预后的一个重要因素[2]，我们发现，低氧环境下，肝癌HepG2细胞侵袭迁移能力增强，特异性HIF-2α siRNA转染后，HepG2细胞侵袭迁移能力受到显著抑制，从而减缓了肝癌的恶性生物学行为，改善患者预后。

综上所述，特异性HIF-2α siRNA转染低氧环境下肝癌HepG2细胞后，HIF-2α表达下调，从而抑制细胞增殖、侵袭迁移，促进细胞凋亡，减缓肝癌的恶性生物学行为。阻断HIF-2α是靶向治疗缺氧肿瘤细胞的关键，有望成为肝癌治疗的新靶点，但其中具体的分子机制仍需要进一步研究探索。

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