辛伐他汀对大鼠肾缺血再灌注损伤后心肌组织p53和caspase-3蛋白表达的影响

荆娇，张永忠，马海玲，闫文升，张玉清，焦宗伟

他汀类药物是三羟基三甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂。自1976年Endo等[1]于桔霉素提取液中发现了美伐他汀，随后洛伐他汀等他汀类药物相继问世。他汀类药物通过对该酶特异性抑制作用，使HMG-CoA不能转变为甲羟戊酸，从而阻断胆固醇的合成，这一作用目前在临床上广泛用于高血脂的治疗。有研究发现，普伐他汀预处理可以通过抑制细胞凋亡保护肾缺血再灌损伤[2]。他汀类药物在防治心脏疾病方面也日益重视，也有研究指出辛伐他汀可剂量依赖性地延迟因缺氧诱导的新生心肌细胞的坏死，减轻心肌初始缺血和再灌注损伤，改善心功能[3]。但他汀类药物对肾缺血再灌后心肌组织的影响却少有报道。我们就此进行了初步研究，通过建立肾缺血再灌注损伤模型，并用辛伐他汀干预，检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及组织丙二醛（MDA）含量，乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及p53和caspase-3的表达。探讨辛伐他汀对肾缺血再灌后心肌的作用， 结果如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，清洁级，体重160～230 g，购自河北省实验动物中心（合格证号DK1411015）。

1.1.2 药品与试剂 辛伐他汀（批号H20000009），杭州上虞京新药业有限公司提供；SCr、血清BUN测试盒，购自北化康泰临床试剂有限公司；MDA、SOD、LDH、CK试剂盒均购自南京建成生物制品公司；β-actin，p53和caspase-3购自Santa cruz biotechnology。

1.2 分组与模型建立

1.2.1 分组 将大鼠在20℃～26℃实验室喂养2 d，然后随机分成3组：①假手术组（Sham）；②肾缺血再灌注组（IR）；③辛伐他汀组（Sim）。每组各12只。完全随机分组方法如下：先将动物按1， 2， 3， 4.......36编号，在随机数字表中第三行第一个数16为开始数，取数取36个随机数，将对应的随机数放在鼠号下面，用随机数除以组数3，余数为1归为假手术组，余数为2归肾缺血再灌注组，余数为3归为辛伐他汀组，再进行随机分组调整完成分组。辛伐他汀组20 mg/kg/d灌胃，持续2周。假手术和缺血组每天给同量的生理盐水灌胃，2周后复制模型。

1.2.2 模型建立 本次实验采用河北省医学科学院的以往方法[4]，复制肾缺血再灌注损伤模型，10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹手术，双侧肾动静脉暴露。肾缺血再灌注组和辛伐他汀组夹闭双侧肾动静脉，45 min后去除动脉夹再恢复血流灌注，然后逐层缝合腹壁。假手术组开腹但不夹闭血管，其余相同。再灌后24 h各组分别于腹主动脉取血4～5 ml，分离留取血清于冰箱中低温保存，待测定血清Scr、BUN含量。然后摘取心脏，冰生理盐水冲净血液， 取左心室前壁部分组织，制备匀浆待检测MDA含量，LDH、CK和SOD的活性及Western blot法检测p53和caspase-3的表达水平。

1.3 检测方法

1.3.1 心肌组织匀浆制备 制备匀浆前除去组织血液，用滤纸吸干，准确称重。将干净、干燥的匀浆管置于冰水混合物中，将组织块放于匀浆管中，尽快剪碎组织，然后按1:9（W/V）加入冰生理盐水，将组织匀浆。而后将匀浆移入干燥的试管中，置于4℃离心机中，以3000 r/min的速度离心10 min。取上清液储存待测。

1.3.2 生化检查 Scr、BUN、一氧化氮（NO）及MDA含量，SOD、LDH、和CK活性。各项指标检测方法严格按试剂盒说明书操作。

1.3.3 Western blot法检测p53和caspase-3的表达 组织蛋白的提取：-80℃低温冰箱保存标本，提取蛋白时取出标本称重，每100 mg组织加入1 ml RIPA，加入10μl PMSF，组织匀浆，低温离心15 min，10000～14000 r/min，取上清加入5×蛋白上样buffer，煮沸5 min分装，-70℃保存，现用现取。提取蛋白后灌胶上样，加样后先用恒流（10 mA），再用恒压（100 V）电泳至溴酚蓝到凝胶底部。待电泳停止后，将凝胶转移PVDF膜上，转移电压为100 V，时间120 min。然后将PVDF膜移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭2 h。取出PVDF膜，加入稀释后的一抗（1:1000）冰箱里4℃过夜。再用TBST室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。然后加入1:1000稀释的辣根酶标记羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，用TBST室温下脱色摇床上洗5次，每次10 min。将显色剂滴加于晾干的PVDF膜上，显色照相。最后用quantity one软件对条带进行分析。

1.4 统计学分析 用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辛伐他汀对BUN和Scr含量的影响 与假手术组比较，肾缺血再灌注组肾功能受损，BUN和Scr含量均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与肾缺血再灌注组比较，辛伐他汀组BUN和Scr含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表1。

表1 各组血清Scr和BUN含量的比较

2.2 辛伐他汀对CK、LDH、SOD活性及MDA含量的影响 肾缺血再灌注组和辛伐他汀组LDH和CK活性均高于假手术组， 差异有统计学意义（P＜0.05）。与肾缺血再灌注组比较， 辛伐他汀组LDH、CK活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。肾缺血再灌注组和辛伐他汀组心肌组织SOD活性均低于假手术组（P＜0.05），MDA高于假手术组（P＜0.05），均有统计学意义。与肾缺血再灌注组相比，辛伐他汀组SOD升高（P＜0.05），MDA减少（P＜0.05）有统计学意义，表2。

2.3 各组心肌p53和caspase-3蛋白的表达测定Western blot法蛋白含量检测显示，与假手术组组比较，肾缺血再灌注组p53和caspase-3表达均显著增高；与肾缺血再灌注组组比较辛伐他汀组p53和caspase-3蛋白表达降低（图1～ 2）。

3 讨论

肾缺血再灌注损伤涉及多种因素，如自由基损伤、白细胞和内皮细胞之间的作用、胞内钙的超载、NO等[5-7]。以往研究指出[8]，缺血缺氧可引起血管内皮细胞的损伤和脂质过氧化物增多，这是引起肾缺血再灌注损伤的关键因素之一。氧化应激是机体内氧自由基生成和去除失衡，或者由于外源性氧化剂超量摄入，导致活性氧（ROS）的积累而引起的毒性过程。在生理状态下，机体产生SOD能快速清除氧自由基等，防止氧自由基的过量积累。Laude研究报道缺血再灌注期间可以产生的大量的氧自由基（OFR），这些过量的自由基经过血液循环到达相应的靶器官造成器官的损伤[9]。目前，缺血再灌注损伤的研究已不仅限于本身，远端器官肺、肾、脑、心等也常常是受累靶器官[10]。戎浩等的研究也发现在缺血再灌注损伤时远端脑组织丙二醛含量增多，超氧化物歧化酶的活性下降，脑组织在此过程中也受到了影响[11]。说明肾缺血后对远端器官是有影响的。虽然经过循环后的OFR浓度有所降低，但产生的各种损失因子也能引起相关器官的OFR相对增加，而导致器官损伤。

图1 辛伐他汀对肾缺血再灌注后心肌p53蛋白表达的影响

图2 辛伐他汀对肾缺血再灌注后心肌caspase-3蛋白表达的影响

表2 各组CK、LDH、SOD活性和MDA含量的比较

细胞凋亡是在一定的病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控和酶促反应进行的细胞程序化死亡。caspase-3是介导凋亡途径中关键的启动因子。能通过寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，在诱发细胞凋亡及细胞增殖抑制等方面发挥着重要的作用[12,13]。有报道指出Caspase-3抑制剂对兔体外循环心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，其机制与抑制凋亡途径中关键蛋白酶Caspase-3的活性有关[14]。张琼等研究表明高、中剂量阿托伐他汀可减少大鼠急性缺血心肌细胞损伤，与能减少心肌细胞凋亡及抑制caspase-3 mRNA表达有关[15]。p53蛋白是广谱的肿瘤抑制因子，在细胞生长周期中的起负调节作用，与细胞周期的调控、DNA 修复、细胞凋亡与肿瘤复发转移等重要生物学功能有关[16,17]。Long[18]发现培养乳鼠心肌细胞在缺氧48 h后可诱导心肌细胞凋亡，同时伴有p53基因表达产物的增加。有研究指出在心肌梗死过程中心肌细胞p53表达明显增加，而且其表达程度与细胞凋亡增加的时相一致，表明p53可能是心肌细胞凋亡的机制之一[19]。宋显晶通过研究阿托伐他汀对心梗后心衰大鼠心肌细胞凋亡作用发现阿托伐他汀可通过抑制细胞凋亡减轻心脏重构，改善心功能[20]。

本实验采取河北省医学科学院以往的方法[4]复制肾缺血再灌注损伤模型（夹闭大鼠双侧肾动脉静脉45 min后去夹再灌注），观察再灌24 h后各项指标变化。结果表明，缺血再灌组肾功能明显受损，Scr和BUN高于假手术组，动物模型复制成功。观察缺血再灌后，心肌脂质过氧化物丙二醛的产生增多，同时作为重要的抗氧化剂的超氧化物歧化酶活性显著降低。LDH是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，心肌细胞LDH活性远高于血清数百倍。CK是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶1，2，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，同工酶MB型主要存在于心肌细胞中，目前同时LDH、CK已作为诊断心肌疾病的有效指标， 本实验观察缺血再灌组LDH、CK活性增加。这说明缺血再灌后，心肌组织过氧化物产生过多，抗氧化剂减少，组织明显受损。而给予辛伐他汀干预后，丙二醛含量降低，而超氧化物歧化酶活性明显升高，LDH、CK活性减弱。这说明辛伐他汀对缺血再灌注器官心肌组织有保护作用。与假手术组比较，p53和caspase-3蛋白表达在肾缺血再灌注组增多，与缺血组相比，p53和caspase-3表达在辛伐他汀组明显降低。这表明在肾的缺血再灌过程中，心肌组织损伤同时过量细胞凋亡也伴有发生，凋亡的大量发生与缺血再灌注时产生的大量自由基可能有一定关系。而辛伐他汀可清除多余氧自由基，减少心肌细胞的氧化损伤，降低p53和caspase-3表达蛋白的表达， 从而抑制细胞凋亡。

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