转氨基作用与氨基酸纸层析实验的改进*

游云悠，魏友煜，左 越，黎威巍，罗丽丹，金科华**

(1.湖北科技学院医药研究院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院基础医学院)

转氨基作用与氨基酸纸层析是一个重要的综合性生化实验，现有的各大高校实验教程只有简单的操作流程，缺乏创新。笔者在做该实验时思考了以下问题：可否用其他缓冲液代替磷酸缓冲液？转氨基时间能否缩短？当小白鼠数量不够时，肝匀浆可否稀释使用？未用完的肝匀浆保存一段时间是否还有活性？添加辅酶-磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PP)能否加快转氨基反应？通过回答这些问题，我们改进了转氨基作用与氨基酸纸层析的方式方法，极大提高了实验效率，现与同行分享。

1 材料与方法

1.1 试剂

磷酸二氢钠、磷酸二氢钾为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，磷酸氢二钠为天津市致远化学试剂有限公司产品，Tris购自上海生工生物工程股份有限公司，氢氧化钠为国药集团产品，巴比妥钠为天津市红岩化学试剂厂产品，丙氨酸为上海如吉生物科技有限公司产品，α-酮戊二酸、谷氨酸、PP购自阿拉丁集团，茚三酮为无锡市展望化工试剂有限公司产品，以上试剂均为分析纯。双圈牌滤纸为杭州沃华化学试剂有限公司产品。

按刘汉才等[1]的方法配制0.01mol/L pH 7.4的四种缓冲液：Tris-HCl缓冲液(缓冲液1)，磷酸缓冲液(缓冲液2)，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(缓冲液3)，巴比妥钠-HCl缓冲液(缓冲液4)。再用每种缓冲液分别配制浓度均为0.1mol/L丙氨酸、α-酮戊二酸和谷氨酸，用NaOH将三者的pH调至7.4。

饱和PP溶液的配制：取10mg PP，加1mL缓冲液2，室温涡旋振荡5min，室温5000r/min离心5min，取上清小份分装，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 制备肝匀浆

脱臼处死小白鼠，取出肝脏，剪碎，按每0.9g肝重加4mL缓冲液的比例，研磨匀浆，室温12000r/min离心2min，取上清小份分装，4℃保存备用。

1.2.2 转氨基反应

向1.5mL离心管中加入丙氨酸、α-酮戊二酸、肝匀浆各100μL，37℃水浴预定时间，100℃加热10min，终止反应。

1.2.3 层析

点样：取直径11cm圆形滤纸，通过圆心作直径将圆等分，取转氨基后的上清液0.5μL点样[2]，取稀释6倍的丙氨酸和谷氨酸0.5μL点样。在滤纸圆心打一直径约7mm的小孔，插入灯芯。展层：将0.05%的茚三酮溶液(溶于75%的乙醇)[3-4]倒入直径10cm的玻璃培养皿中，将滤纸平放在培养皿上，灯芯浸入层析液中，培养皿盖盖在滤纸上，层析至溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时取出滤纸[5]，用吹风机吹干显色，至氨基酸斑点颜色不再加深。所有实验均进行3次生物学重复。

1.2.4 缓冲液类型对转氨基的影响

分别用缓冲液1、2、3、4制备的肝匀浆与同种缓冲液配制的丙氨酸和谷氨酸混合，37℃反应1h，比较转氨基结果。

1.2.5 转氨基时间对转氨基的影响

用缓冲液2配制的肝匀浆与底物混合，分别反应10、20、40、80min，比较转氨基结果。

1.2.6 肝匀浆浓度对转氨基的影响

将缓冲液2制备的肝匀浆用缓冲液2分别稀释2、5、10倍，取不同浓度的肝匀浆分别与底物反应20min，比较转氨基结果。

1.2.7 肝匀浆保存时间对转氨基的影响

将缓冲液2制备的肝匀浆于4℃分别保存2、4、8d，分别与底物反应20min，比较转氨基结果[6]。

1.2.8 PP对转氨基的影响

PP是转氨酶的辅酶，有研究发现PP能提高血清ALT的活性[7-8]。血清中ALT是肝脏合成的，PP是否会激活肝匀浆中ALT的活性？为论证这个假设，我们向转氨基反应体系中加入不同浓度的PP，比较转氨基结果。

取实验步骤1.2.6稀释5、10倍的肝匀浆实验。处理组1(或2)反应体系为：稀释5(或10)倍的肝匀浆100μL，95μL丙氨酸，95μL谷氨酸，10μL饱和的PP。对照组除10μL缓冲液2代替饱和PP外，其余成分与处理组相同。混匀各成分，37℃水浴10min，比较转氨基结果。

2 结 果

2.1 缓冲液种类不影响转氨基反应

缓冲液1、2、3、4制备的肝匀浆进行转氨基反应，均出现丙氨酸和谷氨酸两个斑点(图1，封二)，且两个斑点的颜色深浅和大小接近，表明缓冲液种类不影响转氨基反应。

2.2 转氨基时间可适当缩短

不稀释的肝匀浆转氨基10、20、40、80min结果如图2(封二)。由图可见，反应10min时转氨基作用尚未完全，反应20min以上均出现丙氨酸和谷氨基酸两个斑点，谷氨酸斑点的颜色不再加深。由此，转氨基时间可以缩短至20min，节约时间。

2.3 肝匀浆可适当稀释使用

稀释的肝匀浆转氨基结果如图3(封二)，可见将肝匀浆稀释2、5倍后仍出现两个氨基酸斑点，稀释10倍后转氨基速度下降，生成的谷氨酸较少，谷氨酸斑点较淡。以上结果表明适度稀释的肝匀浆仍能进行转氨基作用。故实验教学时，可适当稀释肝匀浆，提高利用率。

2.4 肝匀浆保存时间不宜过长

保存不同时间的肝匀浆转氨基结果见图4(封二)，随着保存时间的延长，谷氨酸斑点逐渐变淡，表明转氨基作用逐渐减弱，故进行转氨基实验时应尽量用新鲜的肝匀浆。

2.5 PP对转氨基无影响

PP对转氨基的影响见图5(封二)，由图可知无论是否加入PP，转氨基反应均能正常进行，表明PP对本实验无影响。

3 讨 论

本研究改进转氨基反应的方式和方法。①在离心管中进行转氨基反应。实验教程的转氨基反应均在试管中进行，弊端较多。首先试剂利用率低。用于层析点样的反应液只需几微升，而试管内反应液有几毫升，浪费太多。其次，由于反应液多，升降温慢，实验效率低。再次，不便于点样。点样的毛细管(10cm长)比试管(15cm长)短很多，必须将试管内的反应液倾斜至管口才能被毛细管吸取，操作极为不便。在1.5mL离心管中转氨基的3个优点：一是所用试剂减少至原来的十分之一，极大提高了试剂利用率；二是缩短试剂升降温时间；三是方便点样。②将丙氨酸和谷氨酸稀释后点样。转氨基反应体系中丙氨酸、α-酮戊二酸、肝匀浆等体积混合，故丙氨酸加入到缓冲体系后被稀释了3倍。转氨基反应可逆，平衡常数为1.0[9]，即约一半的丙氨酸转化为谷氨酸。综上，反应完成后，丙氨酸与加入前相比共稀释了6倍，故将用于参照的丙氨酸和谷氨酸稀释6倍再点样，使二者的浓度与转氨基后剩余的丙氨酸和生成的谷氨酸浓度相近，从而保证显色后的斑点大小和颜色相似，便于对比迁移率。几乎所有的实验教程中，反应前后的氨基酸都点相同体积，导致未转氨基的丙氨酸和谷氨酸斑点远大于转氨基的，显色后的氨基酸斑点大小相差悬殊。③用移液器点样。实验教程中强调点样要适当，但几乎所有的教程都用毛细管点样，点样量与毛细管在滤纸上的停留时间有关。由于停留时间难以控制，以致无法控制点样量，致使点样成败靠运气，点样适当的要求师生均无法企及。用移液器点样可以精确控制点样量，确保显色后色斑大小相近、适宜。

本研究获得多了项创新成果：①不同缓冲液配制的肝匀浆对转氨基无影响。pH相同的不同种类的缓冲液对ALT的活性无影响，故实验室可根据现有试剂灵活配置缓冲液。②转氨基时间可适当缩短。未稀释的肝匀浆转氨基20min，反应即达平衡点，故用未稀释的肝匀浆进行转氨基时，可将转氨基的时间缩短一半，以节省实验时间。③肝匀浆可适当稀释使用。肝匀浆稀释5倍以内时，对转氨基影响不大；稀释过度时导致转氨基反应不完全。故可将肝匀浆进行适当稀释，以提高肝匀浆的利用率。④肝匀浆可低温适当保存。4℃保存2d以内，ALT活性降幅较小，对转氨基影响不大。但随着保存时间延长，ALT活性降幅增大。⑤PP对肝匀浆中的ALT无激活作用。添加PP未加快转氨基作用，说明肝脏中ALT均已结合PP，无需额外添加，或者脱辅酶-PP的ALT极少，在本研究条件下，未观察到PP对ALT的激活作用。

本研究通过改进转氨基反应的方式方法，极大提高了实验的效率，值得在实验教学中推广。