家兔甲状旁腺自体移植方法的对比研究

李君茹,赵 舸

(山西医科大学第二临床医学院普通外科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:13835103128@qq.com)

近年,甲状腺癌发病率不断上升。据报道,甲状腺全切除术后,约有40.0%的患者会被暂时性的甲状旁腺功能减退困扰[1,2],而有0.4%-32.0%的患者会因永久性的甲状旁腺功能减退降低生活质量[3-5]。由于目前没有对应药物可以完全替代甲状旁腺的功能,自1926年Lahey[6]首次通过甲状旁腺即时自体移植的方式治疗甲状旁腺功能减退并取得疗效以来,甲状旁腺即时自体移植技术成为目前保护甲状旁腺、避免术后永久性甲状旁腺功能减退的唯一替代方法,新的即时自体移植方法不断被提出。然而由于临床标本的收集较困难,对人体移植的甲状旁腺组织形态的观察较少被报道。El-Sharaky等[7]对3名进行了前臂肱桡肌甲状旁腺自体移植的患者于移植后第1,2,4周进行了移植物的电子显微镜检查,虽然从细胞层面上对移植的甲状旁腺细胞进行了研究,但是样本量少,且只对一种移植方法进行了研究,无法为临床选择移植方法提供借鉴。本实验对家兔进行了肌肉颗粒包埋、皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射4种甲状旁腺即时自体移植方法的研究,观察移植效果,以求从组织学角度进一步对比研究4种方法移植的甲状旁腺的情况,为临床提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

取健康成年家兔30只(购于山西医科大学实验动物中心),雌雄不限,体质量2 500-3 000 g,笼养。

1.2 实验分组及移植方法

实验动物随机分为对照组、肌肉颗粒包埋组、皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组、皮下匀浆注射组,每组6只。用10%水合氯醛50-75 mg/kg腹腔注射麻醉,生效后,将家兔仰卧位固定,手术部位剪毛、备皮、消毒。自甲状软骨至胸骨上切迹做纵向切口,逐层切开,随机于一侧气管食管沟及甲状腺周围探查,显露下甲状旁腺。

对照组:仅进行甲状旁腺的探查及暴露。其余各组均游离家兔的下甲状旁腺并完整切除。肌肉颗粒包埋组:将甲状旁腺组织剪碎成直径不超过1 mm的颗粒,并埋入家兔一侧胸锁乳突肌的肌腹中。皮下颗粒包埋组:将甲状旁腺组织剪碎成直径不超过1 mm的颗粒,于家兔腿部皮肤切开约10 mm切口,紧贴真皮层分离出2-3个囊袋,将组织颗粒植入其中。肌肉匀浆注射组:将甲状旁腺组织剪碎后,在0.5 ml生理盐水中将组织碎屑进一步研磨至近似匀浆,使用1 ml注射器将匀浆注射于家兔一侧胸锁乳突肌的肌腹中。皮下匀浆注射组:制作匀浆的方法同前。在家兔腿部皮肤切开约10 mm切口,紧贴真皮层分离出2-3个囊袋,使用1 ml注射器将匀浆注射入囊袋中。

手术过程中,离体的甲状旁腺于室温(22-24 ℃)下保存于生理盐水中,甲状旁腺离体时间不超过30 min,所有移植方式均采用多点即时自体移植。

手术过程中分别记录颗粒制作时间、匀浆制作时间及移植时间(从开始处理离体甲状旁腺组织到移植完毕)。

1.3 HE染色及组织形态学检查

将手术后的每组家兔随机分为3组,分别于移植后第1,2,3周再次麻醉,于相应部位取出对照组探查的甲状旁腺及其他各组移植甲状旁腺的组织进行取材、4%多聚甲醛固定24 h、梯度酒精脱水、透明、石蜡包埋、切片(切片厚度8 μm)、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱水、封片,在光学显微镜下寻找组织中的甲状旁腺细胞,对甲状旁腺细胞的分布、变性及死亡情况进行组织形态学检查。

在光学显微镜下寻找各组所收集标本中的甲状旁腺细胞并拍摄照片,取移植后第1,2,3周每组甲状旁腺细胞密集处的40个随机400倍视野,照片用Image Pro Plus 6.0软件分析空泡变性所占甲状旁腺细胞的面积比以及细胞死亡所占甲状旁腺细胞的面积比。

1.4 统计学分析

肌肉颗粒包埋组、皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组、皮下匀浆注射组的空泡变性、细胞死亡所占面积比分别与对照组行两独立样本均数的t检验,四组之间进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 形态学检查

2.1.1 移植不同时间形态学表现 移植后第1周,对照组以大量巢状分布的主细胞为主,有血管穿行其中,为正常甲状旁腺形态(见图1A)。肌肉颗粒包埋组移植的甲状旁腺组织多呈巢状分布于肌肉组织中,可观察到大量存活的甲状旁腺细胞,部分细胞空泡变性,部分细胞死亡,形成一片颗粒状无定形的红染物(见图1B)。皮下颗粒包埋组皮下组织内可见甲状旁腺细胞;移植的甲状旁腺细胞呈团状分布,可观察到大量存活的甲状旁腺细胞,部分细胞空泡变性(见图1C)。肌肉匀浆注射组可观察到大量存活的甲状旁腺细胞穿插于肌肉组织中,少量细胞空泡变性,部分细胞死亡成为失去细胞结构的红染物(见图1D)。皮下匀浆注射组可见大量存活的甲状旁腺细胞散在分布于皮下组织中,周围被纤维结缔组织及脂肪组织浸润,有血管穿行其中,少量细胞空泡变性,少量细胞死亡成为失去细胞结构的红染物(见图1E)。

图1 术后第1周移植组织染色 (×400)Figure 1 Staining of transplanted tissue at week 1 after surgery (×400)

移植后第2周,对照组以大量巢状分布的主细胞为主,有血管穿行其中,甲状旁腺细胞形态正常(见图2A)。肌肉颗粒包埋组移植的甲状旁腺组织多呈巢状分布于肌肉组织中,可见大量存活的甲状旁腺细胞,部分细胞空泡变性,部分细胞死亡,成为失去细胞结构的红染物(见图2B)。皮下颗粒包埋组移植的甲状旁腺细胞呈散在或巢状分布,可见大量存活的甲状旁腺细胞,有大量新生的血管穿行其中(见图2C)。肌肉匀浆注射组可见大量存活的甲状旁腺细胞散在分布,有新生的血管穿行其中,少量细胞死亡成为失去细胞结构的红染物(见图2D)。皮下匀浆注射组可见大量存活的甲状旁腺细胞散在分布,有新生的血管穿行其中(见图2E)。

图2 术后第2周移植组织染色 (×400)Figure 2 Staining of transplanted tissue at week 2 after surgery (×400)

移植后第3周,对照组以大量巢状分布的主细胞为主,有血管穿行其中,甲状旁腺细胞形态正常(见图3A)。肌肉颗粒包埋组移植的甲状旁腺组织呈巢状分布于肌肉组织中,有新生的血管穿行其中(见图3B)。皮下颗粒包埋组移植的甲状旁腺组织呈巢状分布,有新生的血管穿行其中(见图3C)。肌肉匀浆注射组可见散在分布的甲状旁腺细胞穿插于肌肉组织中,有大量新生血管穿行其中(见图3D)。皮下匀浆注射组可见甲状旁腺细胞散在分布,有新生血管穿行其中(见图3E)。

图3 术后第三周移植组织染色 (×400)Figure 3 Staining of transplanted tissue at week 3 after surgery (×400)

2.1.2 各组组织形态学的统计分析 术后第1周,与肌肉颗粒包埋组相比,皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组和皮下匀浆注射组空泡变性、细胞死亡所占面积比较低(P<0.05,见表1,2);与肌肉匀浆注射组相比,皮下匀浆注射组空泡变性所占面积比较低(P<0.05,见表1)。肌肉颗粒包埋组、皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组、皮下匀浆注射组移植的甲状旁腺细胞空泡变性、细胞死亡所占面积比在术后第1周较对照组更高(P<0.05),在术后第3周与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05,见表1,2)。

表1 对照组、肌肉颗粒包埋、皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射组空泡变性所占面积比Table 1 The area percentage of cellular swelling in control group, intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection group

表2 对照组、肌肉颗粒包埋、皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射组死亡细胞所占面积比Table 2 The area percentage of cell death in control group, intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection

2.2 各组颗粒制作时间、匀浆制作时间及移植时间的统计分析

匀浆制作时间为(5.90±0.58)min;颗粒制作时间为(2.21±0.73)min,两者差异有统计学意义(t=13.754,P<0.05)。

肌肉颗粒包埋组移植时间与皮下颗粒包埋组移植时间差异无统计学意义(P>0.05),其余各组之间移植时间的差异有统计学意义(P<0.05),皮下匀浆注射组操作最耗时(见表3)。

表3 肌肉颗粒包埋、皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射组移植时间Table 3 Autotransplantation time in intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection

3 讨论

随着新的甲状旁腺即时自体移植方法及移植部位不断被提出,如何在保证手术效率的前提下选择成活率最高的移植方式成为临床医生新的困扰。Murray[8]提出将镜下显示移植物存活作为内分泌移植成功的评价标准之一。组织学的研究能够对临床移植方法的选择提供一些参考。因此,本实验通过建立动物模型,从组织学上对移植部位甲状旁腺细胞的情况进行了观察。El-Sharaky等[7]研究发现,移植后的甲状旁腺大约在术后第2周开始显示出增生和活性。本研究参考移植甲状旁腺的恢复规律,分别于移植后第1,2,3周取标本直观地对比研究甲状旁腺细胞存活的规律,以求从组织学角度进一步研究移植甲状旁腺的情况,不仅为实验家兔模型提供了一个有价值的研究平台和空间,而且对临床上移植方法的选择和改进也具有一定价值。

就移植方法而言,颗粒包埋法、匀浆注射法及带蒂血管甲状旁腺移植[9]是目前甲状旁腺自体移植的主要方法。将甲状旁腺组织切成尽可能小的颗粒,使移植物与周围组织之间有更大的接触面积,有利于新生血管的生成从而尽早建立有效的血运。许志亮等[10]通过测量病人术后血钙和PTH值的方法,比较了3种常用自体移植方式,认为多点匀浆注射法可以使甲状旁腺功能更快恢复。本研究通过组织学观察显示,术后第1周肌肉匀浆注射组空泡变性所占面积比与肌肉颗粒包埋组相比较低(P<0.05),肌肉匀浆注射法优于肌肉颗粒包埋法;而皮下颗粒包埋组和皮下匀浆注射组之间无明显差异(P>0.05)。同时我们观察到,与颗粒包埋法相比,匀浆注射法移植的甲状旁腺细胞多呈散在分布,可以与周围的组织更加充分的接触。从时间上看,肌肉颗粒包埋组移植时间与皮下颗粒包埋组移植时间差异无统计学意义(P>0.05),其余各组之间移植时间的差异有统计学意义(P<0.05)。肌肉颗粒包埋法和皮下颗粒包埋法较其他方法更快捷,最耗时的是皮下匀浆注射法。制作颗粒比制作匀浆更加快捷(P<0.05)。

从移植部位上,目前常见的甲状旁腺的自体移植部位有胸锁乳突肌、腹部皮下脂肪组织、前臂肌肉、前臂皮下组织、胸骨前皮下组织、三角肌、胫骨前肌、前臂腕屈肌前筋膜[11]等。本研究中,皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射三种方法均在术后第2周移植部位观察到了新血管的生成及大量甲状旁腺细胞,肌肉颗粒包埋组在术后第3周观察到新生血管。术后第1周,与肌肉颗粒包埋组相比皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组、皮下匀浆注射组空泡变性与细胞死亡所占面积比较低(P<0.05)。皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射三种方式优于肌肉颗粒包埋。肌肉颗粒包埋组、皮下颗粒包埋组、肌肉匀浆注射组、皮下匀浆注射组移植的甲状旁腺细胞空泡变性与细胞死亡所占面积比在术后第1周较对照组高(P<0.05),术后第3周与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。可见4种移植方法都是安全有效的。

本实验也有一定的局限性。由于研究条件的限制,样本量较少,并且我们没有测量家兔术前、术后外周血PTH及血钙的变化,无法进一步验证血PTH及血钙的变化规律与移植的甲状旁腺细胞的组织学形态是否相吻合。

综上,从组织学上看,4种甲状旁腺即时自体移植方法都是有效的,其中皮下颗粒包埋、肌肉匀浆注射、皮下匀浆注射3种方式优于肌肉颗粒包埋。最耗时的移植方法是皮下匀浆注射法。颗粒制作比匀浆制作更加快捷。