鸡大肠杆菌分离鉴定与药敏试验

2018-03-05哈力旦木吾甫尔牙合甫阿不力孜

畜牧兽医科学 2018年21期

关键词：环丙沙星庆大霉素革兰氏

哈力旦木·吾甫尔，牙合甫·阿不力孜

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，乌鲁木齐 830011）

0 引言

为有效控制鸡大肠杆菌病的流行和传播，控制致病菌产生耐药性，临床上初步鉴定为大肠杆菌病后，要进行实验室病原微生物的分离鉴定、药敏试验等工作，以便快速开展合理的诊疗措施，减少损失。

1 材料与方法

1.1 材料选取

本次研究选择了新疆某乡镇的患病肉雏鸡，该养殖场于2017年1月13日发病，出现患病鸡后，病情迅速扩展蔓延，并出现了严重的死亡现象。养殖户卫生条件较差、饲养不当、疫苗免疫不科学，导致疫病在较短时间内向整个鸡舍的鸡群传播流行。发病后，养殖户将患病鸡隔离，自行选择青霉素、链霉素进行治疗，但并没有收到明显的效果。随后养殖户将病情上报了当地兽医单位，兽医到达养殖场后，无菌采集病料在实验室进行病原微生物分离鉴定和药敏试验。

试验器材：滤纸、打孔器、带瓶塞的广口瓶、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、冰箱、天平、无菌蒸馏水、显微镜、载玻片、酒精灯、吸水纸、平皿、接种环、注射器、离心管、镊子、棉签。

试验试剂：革兰氏染色剂、香柏油、二甲苯、普通营养琼脂培养基（LB）、三糖铁琼脂斜面培养基（TSI）、麦康凯琼脂培养基（MAC）、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨、醋酸铅琼脂培养基。细菌微量生化鉴定管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管、甲基红指示剂、VP指示剂、吲哚试剂。用于药敏试验的抗生素主要包括庆大霉素、环丙沙星、阿奇霉素、链霉素、青霉素、磺胺嘧啶钠、阿莫西林。

1.2 试验方法

将抗生素用蒸馏水充分稀释后，制备药敏纸片备用，用样本分离株进行药敏试验。

1.2.1 细菌分离培养

无菌蘸取病料接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，37 ℃恒温培养12～24 h，观察并记录菌落的生长状况。

1.2.2 革兰氏染色镜检

洁净的载玻片上先滴一滴蒸馏水，用接种环蘸取少量单菌落于蒸馏水中，在载玻片上涂抹均匀后用酒精灯外焰进行固定。按照革兰氏染色步骤：初染，结晶紫1 min，冲洗；媒染，革兰氏碘液1 min，冲洗；脱色，95%酒精30 s，冲洗；复染，番红1 min，冲洗并用吸水纸吸干多余水分，载玻片晾干后放置在显微镜油镜下观察[1]。

1.2.3 三糖铁斜面接种试验

将分离得到的致病菌，用接种环转移到三糖铁斜面培养基上，先将致病菌均匀涂布在斜面后，然后再穿刺底层。培养基放置在恒温箱内37 ℃培养24 h，观察斜面底部的颜色变化情况，是否产气、是否产生硫化氢气体。用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管以及甲基红指示剂、VP指示剂、吲哚试剂、香柏油、二甲苯进行生化试验[2]。

1.2.4 药敏试验

无菌环境下使用接种环取培养基菌落1～2个，放入盛有1 mL灭菌生理盐水的离心管内，充分混合均匀后，用无菌棉签沾取溶液，棉签在管壁上用力挤压，除去多余液体，均匀涂布在琼脂营养平板上，室温环境干燥，5 min后，放入提前制备好的药敏纸片，并轻轻按压至能与琼脂平板充分紧贴，牢固后不能再移动，并做好标记。试验注意纸片放置均匀，各个纸片中心距离不得小于2.5 cm，药敏试验的纸片距离平板内缘不得少于15 mm。将制备好的平板在室温条件下，放置10 min，再倒置于37 ℃条件下培养18 h，观察抑菌圈大小。

2 结果

2.1 病原菌分离

接种试验可以发现，从养殖场采集回来的病料，能够在麦康凯琼脂培养基和普通营养培养基上正常生长。在普通营养琼脂培养基上，能够生长出圆形、湿润、光滑、半透明、灰白色、中间突起、成露珠状的致病菌菌落。在麦康凯琼脂培养基上能生成中间稍微隆起、边缘整齐、湿润、光滑，直径在1.5 mm左右的粉红色的致病菌菌落，符合大肠杆菌的病原菌分离特性。

2.2 染色镜检

将分离得到的致病菌进行常规革兰氏染色后放置在显微镜下，镜检可以发现致病菌为两端钝圆、个体中等大小的杆菌，成对或散在存在，无芽孢，无荚膜，不能运动，革兰氏阴性染色，符合大肠杆菌的染色特性。

2.3 生化试验

生化试验结果可以发现，葡萄糖发酵管、甘露醇发酵管和三糖铁斜面培养基产酸产气，使培养溶液颜色发生改变，表面产生大量气泡。不能发酵蔗糖，能够发酵麦芽糖、乳糖。甲基红试验、吲哚试验阳性，VP试验、硫化氢试验阴性。

2.4 药敏试验

根据抑菌圈的大小作为判定该种抗生素对致病菌敏感性高低的标准[3]，结果如表1所示。分离得到的致病菌对庆大霉素、环丙沙星敏感，对阿奇霉素、磺胺嘧啶钠中敏，对青霉素、链霉素、阿莫西林不敏感，这也是养殖户选择青霉素、链霉素治疗没有取得明显效果的主要原因。同时，只有庆大霉素和环丙沙星比较敏感。因此，在明确致病原、开展药敏试验的基础上，引导养殖户选择使用庆大霉素、环丙沙星轮换交替进行防治，在较短时间控制了病情，减少养殖场经济损失。

表1 常见抗生素敏感程度

3 讨论

本次研究通过病原分离、涂片镜检、药敏试验等对该场的发病鸡初步诊断为大肠杆菌病，但由于实验室能力有限，不能对大肠杆菌血清学开展诊断，没有明确致病性大肠杆菌的血清类型，这是今后工作中需要进一步努力的地方。同时，进一步药敏试验还可以发现，从该养殖场分离得到的大肠杆菌，对阿奇霉素、磺胺嘧啶钠呈现一定的耐药性，链霉素、青霉素、阿莫西林对该种致病菌不具备任何抑菌效果，只有庆大霉素、环丙沙星具有较高的敏感性。由于养殖户不合理使用抗生素所致，今后养殖中需要引导养殖户合理用药，严格控制抗生素的使用。