血管紧张素Ⅱ2型受体活化在缺血再灌损伤中的神经保护作用及机制研究*

刘远新，张玉蓉，苗常青

（1.西安体育学院健康科学系，陕西 西安 710068；西安交通大学第一附属医院2.神经内科，3.急诊科，陕西 西安 710061）

血管紧张素Ⅱ2型（angiotensin type 2，AT2）受体活化后对缺血脑卒中动物具有神经保护作用[1]。刺激AT2受体可减少小鼠永久性或暂时性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后梗死面积；还可减少神经细胞凋亡并降低小鼠死亡率[2]。最近有研究指出，AT2受体激动剂C21可使MCAO大鼠缺血半球神经保护细胞因子白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）表达增加[3]。但是IL-10增加与大鼠神经功能改善的关系仍不明确。IL-10是一种抗炎细胞因子，通过激活JAK1-STAT3信号通路发挥作用[4]。研究已证实，IL-10在体内外具有神经保护作用[5-6]。AT2受体激动剂，CGP-42112，不是C21，对葡萄糖剥夺大脑皮质神经元具有保护作用[7]。因而，本研究主要评估AT2受体激动剂CGP-42112在MCAO大鼠以及氧糖剥夺（oxygen deprivation，OGD）原代神经元模型中的神经保护作用，及其与抗炎细胞因子IL-10的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠，体重280～340 g，购于西安体育学院。实验大鼠随机分为Sham组和MCAO组，MCAO组大鼠进一步分为：MCAO组、CGP42112+MCAO组、CGP42112+IL-10中和抗体+MCAO组及IL-10中和抗体+MCAO组，每组各5只大鼠。

1.1.2 实验仪器和试剂 CGP42112、PD123319、TTC染料、MTT和DMSO（美国Sigma公司），TNF-α ELISA试剂盒（广州锐博生物科技公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），IL-10中和抗体（上海安研商贸有限公司），剪切Caspase-3抗体（美国Santa公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑缺血再灌模型的复制 10%水合氯醛麻醉（150～200 mg/kg），然后进颈部手术。显微镜下分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。然后用缝合线结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端，用针头在颈外动脉远端动脉壁上扎1个小口，将线栓从颈外动脉孔插入颈总动脉，通过颈内动脉最后到达大脑中动脉，用缝合线固定线栓，MCAO后3 h拔出线栓，再灌注21 h。模型复制成功的标志是大鼠麻醉清醒后出现手术侧肢体瘫痪，站立不稳。手术成功率约为80%。Sham组大鼠仅分离颈部血管，大脑中动脉不插入栓线，其他手术操作步骤同MCAO组。CGP42112（1 mg/kg）和IL-10中和抗体（0.1 mg/kg）均在大鼠再灌时腹腔注射。

1.2.2 脑梗死体积评估 MCAO手术后24 h，将大鼠麻醉后取脑，置入-20℃冰箱冷冻15 min后，行冠状切片，厚度为1.5 mm。将切好的脑片迅速放入准备 好 的 1% 2，3，5- 三 苯 基 氯 化 四 氮 唑（2，3，5-three，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸盐缓冲液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。脑梗死区域不染色（灰白色），而正常脑组织染为深红色。依据相关文献报道[8]方法计算MCAO后脑梗死体积。

1.2.3 行为学评估 Bederson评分：MCAO手术后24 h，放在空旷的地方进行评分。评分范围在1～3分之间。1分为大鼠提尾悬空时前肢弯曲；2分为侧推时阻力降低；3分为向瘫痪侧转圈。

Beam walk评分测试MCAO手术后24 h大鼠在横梁上的平衡。大鼠放在横梁上1min，评分范围在0～6分之间。0分：以稳定的姿势在平衡木上；1分：抓住平衡木侧面；2分：抱住平衡木，1肢跌下；3分：抱住平衡木，2肢跌下；4分：40～60 s从平衡木跌下；5分：20～40 s从平衡木跌下；6分：20 s内从从平衡木跌下。

1.2.4 ELISA分析 尾静脉抽取MCAO大鼠血液，通过ELISA试剂盒规定的步骤检测血液中TNF-α浓度。1.2.5 原代神经元分离和培养 从妊娠Wistar大鼠17 d胚胎中分离大脑皮层。用冷Hank液冲洗，用剪刀剪碎，并用吸管吹打，然后加入胰蛋白酶消化15 min，加入DEME培养液，将细胞悬液加入新试管中，吸管吹打，静放10 min，重复2、3次。用筛网过滤细胞悬液，加入DEEM培养基，在培养箱中培养10～12 d后进行相关检测。

1.2.6 氧糖剥夺/复氧（oxygen deprivation/reoxygenation，OGD/R） 为模拟体内缺血/再灌注，原代神经元进行OGD 3、6或9 h后复氧6 h。对细胞OGD，把常规细胞培养基换成无糖培养基，后孵育在缺氧培养箱中培养（94%氮气N2，5%二氧化碳CO2，小于1%氧气O2）。复氧即把无糖培养基换成常规培养基，常规培养箱中培养（94%空气，5% CO2）。在OGD实验中，神经元OGD开始前采用不同浓度CGP42112处理。在OGD/R实验中，细胞复氧时采用CGP4211（10、100和 1 000 nmol/L）、AT2受体拮抗剂 PD123319（1 μmol/L）或IL-10中和抗体（1 μg/ml）处理。

1.2.7 MTT分析 实验结束时，96孔培养板加入MTT溶液（0.5 mg/ml），反应4 h。去除溶液，加入DMSO融解结晶物，孵育5 min，使用酶标仪在540 nm处测量吸光值。

1.2.8 Western blot分析 提取原代神经元总蛋白，取20 μg进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上。用兔抗剪切Caspase-3多克隆抗体（1∶1 000）和鼠抗β-actin多克隆抗体（1∶2 000）4℃孵育3 h。用PBS-T稀释山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室温孵育1 h。洗膜后用化学发光扫描系统检测并摄片，以β-actin为内参，应用图像分析软件Quantity one进行吸光度积分值分析。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较用Tukey HSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-10对大鼠体内CGP42112介导的神经保护作用的影响

经方差分析显示，各组间梗死体积比较，差异有统计学意义（F=6.081，P=0.025），与MCAO组大鼠比较，CGP42112腹腔注射可减少MCAO大鼠梗死体积（P=0.032）；而IL-10中和抗体可消除CGP42112诱导的神经保护作用（见图1）。IL-10可能参与CGP42112介导的神经保护作用。经方差分析也显示，各组间Bederson（F=12.142，P=0.013）和Beam walk评分（F=9.749，P=0.019）差异有统计学意义，其中CGP42112处理可改善MCAO手术24 h后 大 鼠Bederson（P=0.017） 和 Beam walk评 分（P=0.026），而IL-10中和抗体可阻止神经功能恢复（见图2）。各组间血液TNF-α浓度差异也有统计学意义（F=20.537，P=0.006），与Sham组大鼠比较，MCAO组大鼠血液中炎症细胞因子TNF-α水平增加。而CGP42112腹腔注射可降低MCAO大鼠血液中TNF-α浓度（P=0.012），IL-10中和抗体也可消除CGP42112的抗炎作用（见图3）。

2.2 CGP42112在体外实验中发挥直接神经保护作用

实验证实，原代神经元OGD 6 h，然后复氧6 h提供最合适的细胞死亡数量。MTT分析显示各组间比较，差异有统计学意义（F=14.537，P=0.018）；与Sham组比较，不同浓度CGP42112（10、100和1 000 nmol/L）处理均可使OGD/R神经元活力增加（P=0.013、0.009及 0.008）（见图 4）。Western blot显示不同组细胞剪切Caspase-3表达差异有统计学意义（F=10.058，P=0.027），其中CGP42112具有抗凋亡作用，CGP42112抗凋亡作用可被AT2受体拮抗剂PD123319抑制，但是IL-10中和抗体对该效应无影响（见图5）。结果表明，CGP42112在体外发挥神经保护作用，且与IL-10无关。

图1 典型TTC染色脑片及定量不同组间梗死体积

图2 各组MCAO手术24 h行为学评分

图3 各组大鼠血液TNF-α浓度 （ELISA）

图4 各组细胞的活力 （MTT）

图5 各组细胞剪切Caspase-3表达 （Western blot）

3 讨论

近年研究已证实，炎症反应在脑缺血/再灌注损伤中发挥关键作用。中枢神经系统中有许多组织和细胞可产生炎症细胞因子，比如IL-10和TNF-Α等[9]。该细胞因子在脑缺血/再灌注引起的炎症损伤过程中广泛参与，在神经元损伤及修复过程中也发挥重要作用。AT2受体广泛分布于中枢神经系统中，研究已经证实，AT2受体可以促进神经细胞的分化和再生，从而具有神经保护功能[10]，但是其确切作用机制仍不明确。该研究证实，AT2受体激动剂CGP42112可能通过IL-10在大鼠暂时性MCAO后发挥神经保护和抗炎作用。此外，目前结果也显示，CGP42112在原代神经元OGD/R损伤中直接发挥神经保护作用，与IL-10调节无关。

最近有报道指出，AT2受体激动剂在肾脏炎症和心肌缺血模型通过刺激活AT2受体发挥保护作用，而且IL-10也在其中发挥作用[11]。黄焱平等人研究发现，CGP42112+缺血/再灌模型组脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达小于Sham组，而IL-4和IL-10表达高于Sham组；PD123319+缺血/再灌模型组脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α表达高于Sham组，同时IL-4和IL-10表达低于Sham组[12]。在本研究主要明确是否IL-10上调与CGP42112的神经保护作用相关。研究结果显示，IL-10中和抗体可消除CGP42112在脑缺血/再灌大鼠中介导的神经保护和抗炎作用。另外，其他试剂也可通过介导IL-10上调从而发挥神经保护作用。例如，内源性肽，黑皮肤素已被证明通过诱导IL-10上调从而减轻脑缺血和创伤性脑损伤后的组织损伤[13]。CGP42112可以刺激不同细胞产生IL-10。CGP42112很难通过完整血脑屏障渗透到大脑中。然而，短暂性MCAO可破坏血脑屏障的完整性[14]。因此，CGP42112可以渗透到缺血脑组织，并刺激未损伤的神经元产生IL-10。

CGP421121也可能通过全身免疫细胞产生IL-10。IL-10可通过调节T淋巴细胞参与全身免疫细胞的神经保护作用[15]。在本研究中，阻断IL-10不能完全逆转MCAO 24 h后大鼠的神经功能改善，提示其他介质也可能参与CGP421121介导的神经保护。

既往研究显示，AT2受体激动剂在体外无神经保护作用[7]。但是本研究中，CGP42112对OGD/R原代神经元具有神经保护作用，表现为神经元存活率增加和细胞凋亡减少。差异可能是由于体外缺血/再灌模型不一样所致。LEE在研究中仅仅采用葡萄糖剥夺，而该研究使用氧糖剥夺并联合复氧。但是CGP42112直接神经保护作用的机制尚待阐明。最近报告指出，AT2受体在神经元线粒体上表达。氧化应激可诱导神经元AT2受体表达增加，从而降低线粒体呼吸[16]。上述结果提示，AT2受体可能通过调节线粒体呼吸发挥神经保护作用。

总之，研究结果表明，IL-10参与AT2受体激动剂CGP42112介导的体内神经保护作用。此外，CGP42112C21对体外原代神经元具有直接的神经保护作用。

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