高效液相色谱－二极管阵列检测器法测定食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸及海松酸含量

党凯茹 ，彭 腾 ，杨 菁 ，禹亚杰 ，匡 宇 ，韩 笑

（1.成都中医药大学药学院·中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地·中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137； 2.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002； 3.四川护理职业学院，四川 成都 611137）

食用土当归 Aralia cordata Thunb.是五加科 木属植物的根及根茎，是商品九眼独活的主流品种，其作药用最早收载于《本草纲目》[1]，味辛、苦，性微温，具有祛风除湿、止痛利尿消肿的功效[2]。该药为多年生草本，主产区为四川，阿坝、凉山、甘孜等州产量最大，陕西、湖北等地亦有分布，为药食两用的传统中药[3]。食用土当归总有机酸是从食用土当归的根及根茎中提取纯化得到的提取物，课题组前期药理试验研究表明，该总有机酸为食用土当归抗炎镇痛的有效成分[4]。总有机酸所含主要化学成分是贝壳杉烯酸、海松酸等二萜羧酸类，贝壳杉烯酸及海松酸为抗炎镇痛的有效成分[5－6]。目前对食用土当归的研究较少，仅限于对其化学成分及药理活性的研究，对食用土当归总有机酸的报道主要针对于其提取纯化工艺和抗炎镇痛药效学方面，质量控制方面的研究未见报道；此外，2015年版《中国药典(一部)》未收载该药，而2010年版《四川中药材标准》也缺乏详细而深入的研究，该药的质量标准基本还处于空白状态。故本试验中通过建立测定贝壳杉烯酸和海松酸含量的高效液相色谱－二极管阵列检测器（HPLC－DAD）法，为食用土当归总有机酸的质量控制提供参考，也为食用土当归药材标准的建立奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20AT型 HPLC仪，SPD－M20A型 DAD检测器（日本岛津公司）；BUG25－12型超声清洗器（必能信超声有限公司）；色谱柱为 YMC－Pack ODS－AQ柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；FA2004N 型电子天平（上海民怡仪器仪表有限公司）；BP121S型电子天平（德国Sartorius公司）；DZG－6020型真空干燥箱（上海信森实验仪器有限公司）；DZKW－4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药

乙腈、甲醇均为色谱纯（美国天地公司）；磷酸为分析纯（成都科龙化工试剂厂）；优普UPT系列超纯水（成都优普电子产品有限公司）；其他试剂均为分析纯。

贝壳杉烯酸对照品、海松酸对照品（均为实验室自制，HPLC仪检测纯度超过98%）；食用土当归 Aralia cordata Thunb.药材购自四川省成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为五加科

木属植物食用土当归 Aralia cordata Thunb.的根及根茎；食用土当归总有机酸（10批自制食用土当归药材样品，批号分别为 201301，201302，201303，…，201310，棕褐色稠膏状）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

混合对照品溶液：称取干燥至恒重的贝壳杉烯酸及海松酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含 225.7 μg 和 283.9 μg 的混合对照品溶液。

食用土当归总有机酸[7]：取食用土当归粉末，加8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1 h，抽滤，合并滤液，减压浓缩干燥，得食用土当归乙醇提取物，乙醇提取物20倍量水溶解后，加NaCl使质量分数达0.50%，2倍量石油醚萃取4次，萃取液浓缩至乙醇提取物20倍量体积，再用1.0%KOH溶液等体积萃取3次，碱水层加浓盐酸使 pH达1，加 NaCl使质量分数达0.50%，用等体积石油醚萃取3次，减压回收石油醚，干燥，即得。

供试品溶液：取食用土当归总有机酸约25 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：YMC－PackODS－AQ柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 0.1% 磷酸水溶液（76 ∶24）；检测波长：202 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：15 μL。在上述色谱条件下分别取混合对照品溶液、供试品溶液自动进样，记录色谱图（见图1）。

图1 高效液相色谱图

2.3 耐用性考察

色谱柱考察：按2.2项下色谱条件，考察了Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），YMC －Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）3 种色谱柱对供试品中贝壳杉烯酸及海松酸的影响，结果见表1。可见，3种色谱柱均可用于食用土当归总有机酸的贝壳杉烯酸和海松酸的含量测定。

表1 色谱柱考察结果

流速考察：按 2.2项下色谱条件，以 YMC－Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，考察不同流速对供试品溶液中贝壳杉烯酸及海松酸含量的影响，结果见表 2。可见，流速在 0.8～1.2 mL ／min 时，测得含量的 RSD值小于3%，分离度也好，均可作为食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸和海松酸的含量测定用流速。

表2 流速考察结果

柱温考察：按2.2项下色谱条件，考察不同柱温对供试品溶液中贝壳杉烯酸及海松酸含量的影响，结果见表3。可见，柱温在25～35℃之间时，RSD值均在3%以内，分离度也好，均可作为食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸和海松酸的含量测定用柱温。

表3 柱温考察结果

2.4 方法学考察

线性关系考察：取混合对照品溶液自动进样，分别进样 10，12，14，16，18，20 μL，以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标分别绘制标准曲线，得贝壳杉烯酸回归方程为 Y＝1.6×106X ＋25 642（R2＝0.999 6，n＝6），海松酸 回 归方程 为 Y＝1.6×106X－20 531（R2＝0.999 6，n＝6）。结果表明，贝壳杉烯酸对照品溶液进样量在 2.257 ～ 4.514 μg，海松酸对照品溶液进样量在2.839～5.678 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：按2.2项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液15 μL，连续进样6次。结果贝壳杉烯酸和海松酸峰面积的 RSD分别为0.27%和0.25%(n＝6)，均小于3%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，于配制后0，4，8，12，16，24 h 时进样 15 μL，测定贝壳杉烯酸和海松酸峰面积。结果的 RSD分别为 0.27%和 0.32%(n＝6)，均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：称取食用土当归总有机酸（批号为201307）6份，每份约25 mg，精密称定，依法制备供试品溶液，以 2.2项下色谱条件进样 15 μL，测定。结果贝壳杉烯酸和海松酸平均含量分别为19.20%和27.43%，RSD 分别为 2.24% 和 1.34%(n＝6)，均小于 3% ，表明该方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的同一批（批号为201307）食用土当归总有机酸6份，约12.5 mg，精密称定，分别精密加入一定量混合对照品溶液，依法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样15 μL。结果见表4。

表4 贝壳杉烯酸与海松酸加样回收试验结果(n＝6)

2.5 样品含量测定

分别称取不同批号的食用土当归总有机酸，依法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样 15 μL，测定样品中贝壳杉烯酸和海松酸的峰面积，按外标一点法计算，结果见表5。

表5 样品中贝壳杉烯酸和海松酸的含量测定结果（%，n＝10)

3 讨论

食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸和海松酸的总平均含量为46.87%，表明提取纯化后的总有机酸中仍可能含有脂肪酸等其他小分子酸。课题组今后可对其纯化研究工艺进行进一步优化，以期得到含量更高的总有机酸，完善以贝壳杉烯酸和海松酸为指标的食用土当归总有机酸的质量标准，同时结合生产，实施工艺放大验证，为食用土当归总有机酸的工业化生产提供依据。海松酸和贝壳杉烯酸均有抗炎镇痛活性，且海松酸平均含量比贝壳杉烯平均含量高8.41%，由此可设想从2个单体成分在总有机酸中含量不同的角度，对各自的抗炎镇痛活性程度进行对比研究。

本课题组前期采用正交试验法对食用土当归中总有机酸的提取工艺参数进行优选，同时采用有机溶剂萃取法与酸碱法相结合的方法，通过单因素试验，从检测器和流动相选择上对总有机酸的纯化工艺进行了优选。检测器比较发现，蒸发光散射检测器（ELSD）所得的图谱中只出现贝壳杉烯酸和海松酸2个峰，无法辨别是否已与其他杂质峰分开；此外，ELSD检测器的准确度和重复性相对较差，故选择DAD检测器进行检测，并参考文献[8]对乙腈 －水（76 ∶24）、乙腈 －0.1%磷酸水（76∶24）、乙腈－0.2%磷酸水（76∶24）3种流动相进行了考察，结果表明，3种流动相均能达到较好分离，但与未加磷酸相比，加了磷酸后所得色谱图的峰形更好，且考虑到色谱柱的使用寿命，故选择酸度较低的乙腈－0.1%磷酸水溶液（76∶24）作为流动相。

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[3]王忠壮，苏中武，李承祜.中药九眼独活的商品调查及生药鉴定[J].中国中药杂志，1994，19（12）：707 － 709.

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