金莲花胶囊高效液相色谱指纹图谱研究

李勇军 ，蒋 礼 ，2，何燕玲 ，2，刘春花 ，陆 苑 ，沈国华 ，许祖超 ，刘 亭

（1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心·国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004； 4.贵州益康制药有限公司，贵州 贵阳 550025）

金莲花为毛茛科金莲花 Trollius chinensis Bge.的干燥花蕾，味苦，性寒，有抗炎、抑菌作用，可用于上呼吸道感染，咽炎，扁桃体炎等的治疗[1－3]。金莲花胶囊是金莲花的干燥花及花蕾制成的单方制剂，能清热解毒、利咽消肿，临床常用于上呼吸道感染，如扁桃体炎、咽炎等的治疗[4－5]。近年来的研究表明，金莲花胶囊的主要有效成分为总黄酮，其中荭草苷、牡荆苷和槲皮素含量最高[6]。季日丽等[7]采用高效液相色谱（HPLC）法对金莲花胶囊中3种黄酮苷含量进行测定，制订了该胶囊的定量方法。谭安菊等[8]发现，不同产地的金莲花药材成分含量存在一定差异。故仅针对中成药的某个有效成分或指标成分进行定性、定量分析，并不能全面有效地控制其质量，通过红外光谱、HPLC法等建立指纹图谱，全面控制产品质量是发展趋势[9]。为了更好地控制金莲花胶囊产品质量，本研究中采用HPLC法建立金莲花胶囊的指纹图谱，为该制剂的质量控制提供更加科学有效的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Prominenece UFLC型液相色谱仪系统 （日本岛津公司，包括2台LC－20AD型二元梯度泵、DGU－20A3型在线真空脱气机、SIL－20AHT型自动进样器、CTO－10Asvp型柱温箱、SPD－20A型紫外检测器、LC－Solution色谱工作站）；AE240型十万分之一电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；CQ－250A－ST型超声波清洗器（上海跃进医用光学器械厂）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。

1.2 试药

对羟基苯甲苹果酸、荭草素 －2－O′′－β－ L－半乳糖、荭草素、牡荆素均由贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室制备，经 MS，1H－MNR，13C－NMR结构确证，经HPLC在多个波长检测，其峰面积归一化含量均大于98%；金莲花胶囊17批（批号依次为20081002，20061201， 20061203，20070101， 20070103，20070104，20070105， 20070106， 20070201， 20070203， 20070301，20090802， 20091106， 20110217， 20100901， 20101201，20100310，编号为 S1～S17），其中 S1～S13由贵州益康制药有限公司提供，S14～S17分别由A药业公司、牙克石市森健药业有限公司、吉林天药本草堂制药有限公司、B药业公司提供；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini5uC18110A柱（250mm×4.6 mm，5 μm ）；流动相：乙腈 － 0.1% 磷酸水溶液，梯度洗脱（0～17 min，7% ～19%乙腈；17～35 min，19% ～22%乙腈；35 ～55 min，22% ～50% 乙腈）；流速：1.0 mL ／min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：230 nm；记录时间：55 min。

2.2 溶液制备

对照品溶液：分别精密称取对羟基苯甲苹果酸、荭草素－2－O′′－β－L－半乳糖、荭草素、牡荆素适量，用甲醇溶解，配置成质量浓度为 7.50，16.65，14.70，2.83 μg ／mL 的混合对照品溶液，备用。

供试品溶液：取金莲花胶囊内容物0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，上清液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

精密度试验：分别取同一批供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果的 RSD介于0.8% ～1.9%。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）”进行相似度计算，以第1次进样所得色谱图为参照，其余5次进样所得色谱图与之比较，结果相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批供试品溶液6份，测定其指纹图谱，采用同一系统进行相似度计算，以第1次进样所得色谱图为参照，其余5次进样所得色谱图与之比较，结果相似度均大于0.99，表明指纹图谱重复性良好。

稳定性试验：取同一批供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样，测定各指标成分峰面积。采用同一系统进行相似度计算，以第1次进样所得色谱图为参照，其余5次进样所得色谱图与之比较，结果相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的建立及相似度计算

图1 17批金莲花胶囊样品指纹图谱

指纹图谱的建立：取17个批次的金莲花胶囊，按2.2项下方法平行制备供试品溶液17份，按2.1项下色谱条件进行测定，并将结果导入前述评价系统进行色谱峰匹配，生成对照图谱，并对17批次金莲花胶囊样品进行相似度计算。结果见图1和表1。

表1 17批金莲花胶囊相似度比较结果

主要色谱峰的指认：选择17批次金莲花胶囊样品中共有色谱峰作为指纹图谱的共有峰，有23个共有峰，通过对照品和高效液相色谱－二极管阵列检测器－质谱（HPLC－PDA－MS）归属了4个色谱峰，详见图2。

图2 金莲花胶囊指纹图谱及混合对照品图

指纹图谱相似度评价：由表1可见，贵州益康制药有限公司生产的13批次金莲花胶囊与对照指纹图谱相似度均大于0.87，较稳定；而4批非益康制药公司生产的制剂指纹图谱与共有模式比较，除S15和S16的相似度为0.88和0.79外，S14和S17与益康制药公司金莲花胶囊的共有模式比较，相似度为0.48和0.50，说明不同厂家生产的金莲花胶囊差异较大。

3 讨论

本试验中分别以甲醇、乙醇及70%，50%，30%甲醇为溶剂，超声提取，测定，以色谱中峰的信息量、制剂中各色谱峰的单位质量峰面积及对照品含量为指标，考察不同溶剂的提取效果，指纹图谱及测定结果表明，甲醇超声提取效果较好，且不同浓度的甲醇提取对指纹图谱中各共有峰的提取率有一定差异。经比较，最终采用70%甲醇为提取溶剂。

本试验中利用PDA检测器在190～400 nm波长进行全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析、比较。结果表明，金莲花胶囊的指纹图谱在230 nm波长处检测时，较其他波长检测的信息量大，能兼顾各成分色谱峰的丰度、分离度和基线，而4个对照品在230 nm波长处均有吸收，有较高的灵敏度，故选择230 nm作为检测波长。

本研究中首次建立了金莲花胶囊的HPLC指纹图谱，共标定了23个共有指纹峰，指认了4个色谱峰。采用相似度分析对不同批次金莲花胶囊指纹图谱进行评价，发现不同厂家样品的质量存在一定差异，其中2批相似度较低样品（S14，S17）的指纹图谱中出现其他15批制剂指纹图谱中没有的较大的峰，经质谱分析为芦丁，疑为在金莲花胶囊添加了芦丁。金莲花胶囊现行标准比较简单，难以保证其质量的稳定，而指纹图谱能更全面地表征药品信息，并反映其一致性和稳定性，可为提升金莲花胶囊的质量标准提供参考。

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