异牡荆素对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响

任静娜+饶本龙+马宏昕+沙毛毛+匡怡+许正新

[摘要] 探究異牡荆素对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾通道电流的影响。该实验采用MTT检测法探究异牡荆素的安全范围，结果显示该药物的IC50 10～30 μmol·L-1，而膜片钳实验所选用的药物浓度1～3 μmol·L-1均在该安全范围之内。此外，采用主动脉逆行灌流单酶解法得到单个心室肌细胞，应用全细胞膜片钳技术引导、记录大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）并分析在给予异牡荆素（IV）前后该电流特征的变化。当IV终浓度低于0.1 μmol·L-1时，其对Ito无明显影响，但随着浓度的升高（≥0.3 μmol·L-1），Ito峰值逐渐降低[由给药前的（32.32±2.9） pA/pF分别降为（25.83±4.3） pA/pF，1 μmol·L-1 IV和（19.51±3.5） pA/pF，3 μmol·L-1 IV]，呈现出浓度依赖性抑制现象。在1～3 μmol·L-1浓度内，IV使Ito的I-V曲线明显下移。激活曲线结果显示，IV可使最大半数激活电位（V1/2）向正值方向移动[给药前V1/2为（19.59±1.6） mV，给药后V1/2分别升高（22.81±1.7） mV，1 μmol·L-1 IV；（28.86±1.4） mV，3 μmol·L-1 IV]，同时激活曲线右移。Ito稳态失活曲线的最大半数失活电位（V1/2）：给药组（-61.81±1.3） mV，1 μmol·L-1和（-71.50±1.4） mV，3 μmol·L-1较给药前（-51.43±0.99） mV显著降低。而就失活后恢复曲线的失活时间常数（τ）而言，给药后的τ较给药前明显升高[给药前（94.89±0.73） ms；给药后（118.5±1.5） ms，1 μmol·L-1；（162.4±1.4） ms，3 μmol·L-1]，IV使Ito的失活后恢复曲线右移，提示其能延长瞬时外向钾通道的失活后恢复时间。异牡荆素对大鼠心室肌细胞的Ito具有明显的抑制作用。

[关键词] 乳鼠； 异牡荆素； 心室肌细胞； 膜片钳； 2相折返； 瞬时外向钾电流

[Abstract] To investigate the effects of isovitexin Ⅳ on transient outward potassium current in rat ventricular myocytes. In this study， MTT assay was used to investigate the safe range of isovitexin. The results showed that the IC50 of the drug was in the range of 10-30 μmol·L-1， and the drug concentration of 1-3 μmol·L-1 for the patch clamp test was within the safe range. In addition， the single ventricular myocytes were obtained by single-enzymatic hydrolysis through aortic retrograde perfusion. The transient outward potassium current （Ito） of rat ventricular myocytes was guided and measured by whole-cell patch-clamp technique and the changes of current characteristics were recorded after isovite was applied. When the concentration of IV was less than 0.1 μmol·L-1， there was no significant effect on Ito. However， with the increase in the concentration of IV （≥0.3 μmol·L-1）， the peak of Ito was decreased gradually， from （32.32±2.9） pA/pF to （25.83±4.3） pA/pF， 1 μmol·L-1 IV and （19.51±3.5） pA/pF， 3 μmol·L-1 IV respectively， with an inhibition effect in a concentration-dependent manner. In the range of 1-3 μmol·L-1， IV down-regulated the I-V curve of Ito significantly. The activation curve showed that IV can enable the maximum half activation potential （V1/2） to move to the positive direction， and the V1/2 was increased from （19.59±1.6） mV to （22.81±1.7） mV and （28.86±1.4） mV at concentration of 1， 3 μmol·L-1， meanwhile the activation curve moved to the right. However， the maximum half inactivating potential （V1/2） of the steady-state inactivation curve of Ito was significantly decreased from （-51.43±0.99） mV to （-61.81±1.3） mV with concentration of 1 μmol·L-1 and （-71.50±1.4） mV with concentration of 3 μmol·L-1. The inactivation time constant of recovery from inactivation （τ） was up-regulated significantly from （94.89±0.73） ms to （118.5±1.5） ms and （162.4±1.4） ms at concentration of 1， 3 μmol·L-1respectively. Meanwhile IV could enable the inactivation recovery curve to move to the right， which suggested that it can prolong the recovery time from inactivation of the transient outward potassium channel. In conclusion， isovitexin had a high inhibitory effect on Ito in rat ventricular myocytes.endprint

[Key words] neonatal rat； isovitexin； ventricular myocytes； patch clamp； phase 2 reentry； transient outward potassium current

黃酮类化合物（flavonoids） 是植物的次生代谢产物，包括多种氧苷黄酮和碳苷黄酮。碳苷黄酮是指糖基以C-C键直接连接在黄酮母体上[1]，文献报道，该类化合物具有舒张血管、抗癌、抗血小板和抗心律失常等一系列作用[2-4]。从结构上来看，异牡荆素（isovitexin，IV）属于碳苷黄酮类活性物质，广泛存在于自然界几十种植物的根、茎、叶、树皮、果实和种子中。现有的相关数据显示，IV具有多种药理学活性，包括降血糖[5]、抗菌[6]、调节记忆[7]、抑制α-葡萄糖苷酶[8]、降血压和抗氧化[9-10]等作用。但有关该化合物其他方面的作用则尚未见专门的研究，这为作者继续深入探究提供了空间。本实验拟从离子通道方面着手，利用细胞膜片钳技术，探讨IV对急性分离大鼠心室肌细胞中瞬时外向钾电流（transient outward potassium current，Ito）的影响，继而对IV的药理学机制作一个判断和评价。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠，体质量180～300 g和出生1～3 d内的SD乳鼠均由扬州大学比较医学中心提供，雌雄不限。

1.2 药品与试剂 异牡荆素购自成都普思生物科技有限公司，胶原酶Ⅱ购自Worthington公司，glucose，Taurine，HEPES购自美国Sigma公司，其余均为国产分析纯。胰酶细胞消化液购于碧云天生物技术公司，DMEM和胎牛血清（FBS）均购于美国 HyClone公司。

1.3 试剂配制 无钙台氏液：NaCl 136 mmol·L-1，KCl 5.5 mmol·L-1，NaH2PO4 0.3 mmol·L-1，MgCl2 1.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，glucose 10.9 mmol·L-1。用NaOH调pH 7.35～7.40。台氏液：无钙台氏液中加1.8 mmol·L-1CaCl2即可。酶液：无钙台氏液中加0.4 g·L-1胶原酶Ⅱ，1 g·L-1BSA，0.4 g·L-1 taurine，30 μmoL的CaCl2。KB液：L-glutamic acid 70.0 mmol·L-1，taurine 10.0 mmol·L-1，KCl 25.0 mmol·L-1，NaH2PO4 10.0 mmol·L-1，EGTA 0.5 mmol·L-1，glucose 11.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，KOH 89.0 mmol·L-1，用KOH调pH 7.35～7.40。电极内液：KCl 40.0 mmol·L-1，MgCl2 1.0 mmol·L-1，K2ATP 5.0 mmol·L-1，K-aspartate 106.0 mmol·L-1，EGTA 10.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，用KOH调pH 7.30。细胞外液：台氏液。

1.4 乳鼠心室肌细胞分离及培养[11] 取乳鼠8只常规皮肤消毒，在无菌条件下开胸取心室组织，用4 ℃ PBS冲洗2～3次，剪成1 mm3的小块，加4 mL 0.25%胰酶，在37 ℃水浴中分4次消化，每次约10 min。收集除第1次以外的细胞悬液于离心管中，加入适量含胎牛血清的培养基，终止胰酶对细胞的酶解作用，经200目滤网过滤，去除未消化组织及细胞团。离心5 min弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液后接种于培养皿中，放置37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育1.5 h后弃贴壁细胞，获得高纯度的心室肌细胞。

1.5 细胞活力检测试验（MTT试验） 将乳鼠心室肌细胞消化成单细胞悬液，每孔100 μL接种到96孔培养板中，铺板使待测细胞密度为8 000～1万个/孔，然后置于培养箱中培养过夜。向96孔板中加入不同浓度的IV，共5组（分别为0，1，3，10，30 μmol·L-1），每组5个复孔，分别孵育24，48 h后，每孔加10 μL MTT溶液（5 g·L-1）；培养4 h后吸弃上清液，每孔加100 μL DMSO，在摇床上低速振荡10 min后用酶标仪测定490 nm波长处吸光度A490，试验重复3次，取平均值。

1.6 大鼠心室肌细胞的分离 大鼠心室肌细胞的分离参照有关报道[12]并有所改良。大鼠腹腔注射肝素2 000 IU·kg-1，约10 min后再腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1），麻醉成功后迅速开胸，取出心脏，置于4 ℃无钙台氏液中进行清洗，简单修剪后将主动脉插入改良过的Langendorff灌流架上结扎固定。先台氏液灌流使心脏复跳30 s排除内部血污，随后换用无钙台氏液灌流5～10 min，再用含钙的酶溶液灌流20～30 min，直至心脏开始明显胀大、透明、滴出液变浑浊、切块镜检时出现长杆状细胞为止迅速终止消化。整个灌流过程保持恒温37 ℃及持续充氧。消化停止后迅速剪下心室组织，在KB液中剪碎、过滤，滤液置室温，静置10 min后弃上清液，KB液清洗，如此反复3次，然后避光室温放置2～3 h备用。

1.7 全细胞膜片钳记录 将心室肌细胞置于培养皿中，细胞外液灌流10 min。待其贴壁后，在倒置显微镜下选择长杆状、横纹清晰、立体感强的细胞进行后续的一系列操作。所有实验均在室温下进行。

1.8 电极等试验条件 试验中使用的玻璃微电极由程序化的P-97水平拉制仪拉制而成，主要使用参数为电极入液后电阻保持在2～4 MΩ，串联电阻补偿为60%～70%。

1.9 统计分析 采用PatchMaster软件采集所记电流，用Origin 7.0软件对实验数据进行转换并结合Graphpadprism 6.1对数据进行分析和拟合。使用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计处理，所有实验数据均以±s表示，统计学检验的标准为P<0.05。endprint

2 结果

2.1 IV对乳鼠心室肌细胞活力的影响 为了探讨IV对心室肌细胞活力是否有影响，本研究采用MTT法检测不同浓度的IV处理前后的细胞活力，见图1。当细胞培养至24 h时，与对照组相比，IV浓度在0～3 μmol·L-1细胞活力均无明显下降；然而当浓度增加至10～30 μmol·L-1时，细胞活力逐渐降低（P<0.01），说明此浓度范围的IV对细胞有一定的毒性。当细胞培养至48 h时，与对照组相比，IV浓度在0～3 μmol·L-1细胞活力逐渐降低（P<0.05）；当IV浓度达到30 μmol·L-1时，细胞活力下降尤为显著（P<0.01），提示此浓度范围的药物对细胞产生的毒性较大。综上可知，细胞活力随药物浓度的增加和时间的延长而逐渐降低，并且IV的IC50可能在10～30 μmol·L-1。

2.2 IV对大鼠心室肌细胞Ito的影响 为了探究IV是否能对Ito产生影响，本实验采用方波单刺激方案。在电压钳模式下，保持电位-80 mV，给予70 mV、持续时间300 ms的方波单刺激，见图2。结果表明，给予Ito的特异性阻滞剂（2 μmol·L-1 4-AP）后，电流几乎被完全抑制，表明所记录到的电流是Ito，而与给药前（对照组）相比，IV浓度为1 μmol·L-1时，Ito明显减小（P<0.01），提示IV对Ito具有显著的抑制作用。

2.3 不同浓度的IV对Ito的影响 为了进一步阐明以上抑制作用与药物浓度大小的相关性，本实验采取累积加药法给药10 min后观察不同浓度的IV对心室肌细胞Ito的影响（0.1，0.3，1，3，10 μmol·L-1），刺激方案同2.2项。结果表明，当Ⅳ的浓度为0.1 μmol·L-1时，其对Ito无明显影响，而浓度增加到0.3 μmol·L-1时，则呈现出较弱的抑制作用。随着药物浓度的持续增加（≥1 μmol·L-1），IV的抑制作用逐渐增强，其中，1，3 μmol·L-1 IV使Ito的峰值电流密度由给药前的（32.32±2.9） pA/pF分别降为（25.83±4.3），（19.51±3.5） pA/pF （P<0.01），见图3。由此说明，IV对Ito的抑制具有浓度依赖性。

2.4 IV对Ito电流-电压（I-V）曲线的影响 在电压钳模式下，保持电位-80 mV，给予-50～70 mV、阶跃10 mV、持续时间500 ms的方波串刺激，刺激频率0.5 Hz，记录给药前后的Ito，以电流密度对相应的膜电位作图绘制出Ito的I-V曲线，见图4。结果显示，与给药前（对照组）相比，IV浓度为1 μmol·L-1时，Ito的峰值电流密度明显减少（P<0.01），并且随着膜电位的增加而逐渐升高；而浓度为3 μmol·L-1时，也表现出相同的趋势；两给药组间相比，当IV为3 μmol·L-1时，Ito的峰值电流密度被抑制的更为显著。随后采用正常细胞外液进行洗脱，此时Ito的峰值电流密度较加药组有所回升，表明Ito的抑制效应是IV直接作用的结果。提示IV对Ito具有明显的抑制作用。

2.5 IV对Ito激活动力学特性的影响 为了阐明IV对Ito的激活过程有没有影响，考察观察不同浓度的IV给药前后Ito激活曲线的变化。由于在前述的实验中1，3 μmol·L-1的IV能明显地对Ito产生影响，因此，后续的给药方案即以此2个药物浓度为参考。刺激方案同2.4项，采用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp [（V1/2 -V）/k]}对所得实验数据进行拟合，得到稳态激活曲线，其中，V1/2为半数激活电位，k为斜率，I为测试脉冲引出的峰电流值，Imax为最大峰电流值，见图5。不同浓度的IV均能使Ito的激活曲线明显右移。其中，给药前V1/2为（19.59±1.6） mV，给予1 μmol·L-1的IV后，V1/2变为（22.81±1.7） mV；而给予3 μmol·L-1的IV，V1/2升高到（28.86±1.4） mV（P<0.01）。V1/2向正值方向移动，表明药物可以使Ito不易被激活。

2.6 IV对Ito失活动力学的影响 采用双脉冲刺激法，保持电位-80 mV，条件脉冲从-120 mV开始逐步去极化至30 mV，阶跃10 mV，持续时间1 000 ms，然后再给一去极化至70 mV，持续时间300 ms的测试脉冲，采用Boltzmann方程进行拟合，得到稳态失活曲线，其中，V1/2 为半数失活电位，k为斜率因子，见图6，表1。结果显示，IV能使Ito的失活曲线显著左移，即向超极化方向移动，1 μmol·L-1的IV使V1/2由给药前的（-51.43±0.99） mV降为（-61.81±1.3） mV，而使3 μmol·L-1的IV降至（-71.50±1.4） mV（P<0.01）；另外，1，3 μmol·L-1的IV可使k由给药前的（16.65±0.88）分别变为（14.01±1.2），（10.98±1.3） （P<0.01）。结果表明，IV可明显改变Ito的失活动力学特征，加快Ito的失活。

2.7 IV对Ito失活后恢復动力学的影响 前述实验结果已经表明IV可明显加快Ito的失活，本实验采用双脉冲刺激法，保持电位-80 mV，给予去极化至70 mV的刺激，持续200 ms，回到保持电位持续50 ms后，再给予去极化至70 mV，200 ms的刺激，前后2个脉冲的间隔时间以50 ms的幅度逐渐增加，共20个脉冲；用单指数方程I/Imax =1-exp（-t/τ）拟合，τ为失活时间常数，见图7，表1。结果显示，IV可使Ito的失活后恢复曲线明显右移，其中，对照组τ=（94.89±0.73） ms；IV组中1 μmol·L-1 IV，τ=（118.5±1.5） ms；3 μmol·L-1 IV，τ=（162.4±1.4） ms，P<0.01。相比较而言，1 μmol·L-1的IV对Ito的失活后恢复曲线影响较小，而3 μmol·L-1的IV可明显改变Ito的失活后恢复动力学特征，使Ito失活后恢复的时间延长，这种电生理作用具有潜在的应用价值和临床意义。endprint

3 讨论

心肌细胞中钠、钾、钙等离子通道保持动态平衡是心脏正常工作的基础，当离子通道间平衡失调将导致心肌电信号传导紊乱，进一步诱发心律失常[13]。研究表明，钾通道是抗心律失常药物作用的一个重要靶点[14]，在调节细胞兴奋性、膜电位及收缩舒张活动中具有重要作用，而Ito主要参与心肌细胞动作电位l相复极，其电流幅值及动力学特征的改变可间接影响到其他通道电流的激活和失活过程，进而对动作电位的形态和时程产生一定的影响[15]。大量研究显示Ito在心房颤动、心力衰竭、心肌梗死等多种心血管系统疾病的发展过程中出现功能异常，并且常伴有心律失常并发症[16-18]。因此探究Ito的异常变化可以为今后治疗心脏疾病及抗心律失常药物的研发提供理论依据和临床用药指导。

本项研究对黄酮类化合物IV在大鼠心肌细胞上瞬时外向钾通道电流特性进行分析，结果表明，IV对Ito的电流幅值有明显的抑制作用，使I-V曲线下移且抑制作用呈明显的浓度依赖性，进而导致心肌细胞外向钾电流减少。有研究显示，Ito在心脏的分布具有明显的异质性，其密度增加可导致心外膜心肌细胞复极离散度增大而引起2相折返，诱发致命性的室性心律失常[19-20]；而IV對Ito的抑制作用可能会通过延长动作电位复极时间及有效不应期，减少跨壁复极不均一性，扭转2相折返，避免心律失常的发生。此外，在心肌细胞Ito的恢复和失活过程中也有可能激发2相折返，而Ito的激活、失活和失活后恢复等各项动力学特征的改变可影响心肌细胞电生理特性。本研究结果显示，IV抑制电流的效应与Ito激活有关，给药后发现，Ito稳态激活曲线向膜电位的正值方向移动，半数激活电压远离静息膜电位，使通道不易被激活；而给药组的失活曲线左移，加快Ito的失活，并延长失活通道的恢复时间，减缓Ito从失活态到静息态的恢复过程；以上几个动力学参数的改变均对瞬时外向钾通道有影响，因此作者认为，IV可能通过减少瞬时外向钾通道的开放频率而抑制Ito。

有研究证实[21]IV是一种安全性高的药物，该药可以快速地分布于身体的各个组织中，随着时间的延长，大多数组织中的药物浓度会显著降低，表明该药物并不会在体内长期积累而引发毒性反应，这为该药在后续的研发中提供了安全性的依据。另外，MTT实验结果也证实了IV的IC50在10～30 μmol·L-1，而膜片钳实验所用药物浓度（1～3 μmol·L-1）在安全范围之内，因此，可以证明Ito的抑制效应是药物作用的结果而不是细胞毒性所引起的。本实验首次采用全细胞膜片钳技术研究IV对心肌细胞离子通道的作用特性来评估其对大鼠心脏电生理的影响，但对瞬时外向钾通道相关基因和蛋白的表达尚未涉及，因此，IV对钾通道影响的具体调控机制还不清楚。为了进一步探讨IV的药理学特性和体内作用机制，今后还需在病理模型上就该药物对钾通道的其他亚型进行相关实验研究，从而为该药的深入开发及能否作为抗心律失常药物提供直接的证据和相关的理论指导。

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[责任编辑 张燕]endprint