基于UPLC/QTOF-MS技术观察花旗泽仁对SD大鼠体内尿液代谢组学的影响

韩东卫，朱蕾，张宇驰，于鹏洋，葛鹏玲

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

2型糖尿病胰岛素抵抗是一种典型性代谢类疾病，可引起机体多器官多系统的代谢紊乱[1]。代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。相比于全基因组、蛋白质组，其代谢物信息更简单，可直接将代谢信息与病理生理过程中生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程[2]。因此近年来代谢组学在2型糖尿病胰岛素抵抗的研究中得到广泛应用。

花旗泽仁由西洋参、薏苡仁、泽泻等组成，具有补气、健脾、生津、清热、利湿之功，是临床治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的经验方。本研究通过观察花旗泽仁对大鼠尿液代谢组学的影响，探讨花旗泽仁改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠55只，雄性，3月龄，体质量(200±20)g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(黑)2013-004。

1.2 药物与试剂

西洋参、泽泻及薏苡仁购于黑龙江中医药大学附属第一医院中药局；链脲佐菌素(STZ,BIOSHARP公司)；马来酸罗格列酮(天津葛兰素史克有限公司)；诺和灵R生物合成人胰岛素(丹麦诺和诺德公司)；亮氨酸-脑啡肤标准品(Sigma公司)；罗康全活力型血糖试纸(德国罗氏诊断有限公司)。

1.3 仪器

液相色谱/四级杆-飞行时间串联液质联用仪(美国Agilent 公司)；VORTEX-GENIE 2涡旋混合仪(美国Scientific 公司)。

2 方法

2.1 花旗泽仁水煎液的制备

分别取西洋参15 g、薏苡仁30 g、泽泻15 g，合并3次水煎液，过滤后水浴浓缩至每毫升含0.54 g生药的药液，4℃保存。

2.2 造模

参照艾静和魏伟等[3-4]方法复制2型糖尿病胰岛素抵抗模型。

2.3 样品采集与预处理

血液样本采用大鼠眼眶静脉丛取血。尿液样本另取SD大鼠10只，于给药前及给药后12 h采集尿液样本，给药前禁食12 h，给药剂量为1 mL/100 g。取尿液100 μL，加入400 μL低温甲醇，震荡混匀30 s，12 000 rpm低温离心15 min，取上清液进行HPLC-MS/MS分析。

2.4 空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)及胰岛素敏感指数(ISI)检测

采用血糖仪检测FBG。取适量血清，按胰岛素放射免疫分析试剂盒说明书，检测FINS。采用李光伟法[5]计算胰岛素敏感指数(ISI)。

2.5 色谱检测条件

仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS，分离色谱柱为C18色谱柱。色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.35 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序：0～1 min，5% B；1～6 min，20% B；6～9 min，50% B；9～13 min，95% B；13～15 min，95% B。进样量为4 μL，自动进样器温度4℃。

2.6 质谱条件

正离子模式条件为：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600 L/h、萃取锥孔4 V。负离子模式条件：毛细管电压3.5 kV、锥孔电压50 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气700 L/h、萃取锥孔4 V。离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50～1 000 m/z。

2.7 数据分析

3 结果

3.1 各组大鼠体质量、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)及胰岛素敏感指数(ISI)的比较

如表1所示，与模型对照组比较，花旗泽仁组空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)水平明显下降(P<0.001)，胰岛素敏感指数(ISI)显著升高(P<0.05)。

表1 各组大鼠体质量、空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数的比较

注：与空白对照组比较，△△△P<0.001，△△P<0.01；与模型对照组比较,***P<0.001，*P<0.05

3.2 大鼠尿液代谢组学分析

3.2.1 原始色谱图检查

如图1和图2所示，通过对QC样本的总离子流色谱图(TIC)进行可视化检查，样品图谱的稳定性和重复性均符合代谢组学分析要求。

图1 正模式下QC样本的总离子流图

图2 负模式下QC样本的总离子流图

3.2.2 差异性代谢产物的筛选及鉴定

结果显示,空白尿液和给药12 h后尿液在正离子检测模式下共发现13种差异性代谢物，负离子模式下共发现11种差异性代谢物，差异性代谢物数据如表2与表3所示。

表2 正模式下的差异性代谢物

表3 负模式下的差异性代谢物

4 讨论

代谢组学能够探讨机体内源性代谢产物的变化，客观真实的反映机体已经发生的改变。目前已广泛应用于糖尿病的中医证候本质研究、代谢产物、发病机制、并发症及药物评价等方面，对2型糖尿病的早期诊断、预防、治疗具有重要的指导意义[6]。课题组前期研究表明，中药复方花旗泽仁具有降低空腹血糖、改善高血脂状态、调节脂肪因子水平及抗氧化应激的作用，可以在一定程度上改善胰岛素抵抗[7-9]。

本实验从尿液代谢组学角度，利用UPLC-Q/TOF-MS仪器对两组尿液样本(空白尿液与给药后12 h尿液)进行代谢组学全谱分析。结果表明,花旗泽仁主要参与体内蛋白质的合成与代谢过程，其中4-Guanidinobutanoic acid(4-胍基丁酸)参与体内精氨酸和脯氨酸的生物合成，研究表明，精氨酸通过激发β细胞内已存储胰岛素的释放，对胰岛β细胞有较强的兴奋作用[10]。王觐研究表明[11]，脯氨酸可以降低KM小鼠餐后2 h血糖及曲线下面积。Homogentisic acid(尿黑酸)及Dopaquinone(多巴醌)参与苯丙氨酸和酪氨酸的代谢过程。高贝贝[12]研究结果显示，芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)浓度升高可能会增加糖尿病发病风险。差异代谢物Gentisic acid(龙胆酸)主要参与芳香烃的生物降解过程，表明花旗泽仁可能具有降解芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)的作用，进而改善糖尿病胰岛素抵抗。此外，PGK2(磷酸甘油酸激酶2)是一种参与经由糖酵解葡萄糖代谢的关键酶[13]。Niacin(烟酸)在人体内转化为烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与调节体内脂质代谢、组织呼吸的氧化过程及糖类无氧分解的过程[14]。

综上所述，中药复方花旗泽仁改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制可能与蛋白质的合成与代谢、芳香烃的生物降解过程、体内脂质代谢组织呼吸的氧化过程以及糖类无氧分解等过程有关。

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