健脾活血方阻止EMT,抑制LPS诱导的HepG2细胞迁移和侵袭研究

龙惠,林文新,孙昌洁,邓锦玲,张玉艳,吴小纯

(广州市皮肤病防治所，广东 广州 510095)

肝癌是中国和世界上常见的肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率[1-2]。肝癌的发生和慢性乙肝有着密切的联系。慢性乙型肝炎是临床上常见的传染病，在我国1～59岁的人群中HBV携带率高达7.18%，HBV病毒能够促进肝癌的发生发展[3-4]。有研究表明,患有慢性乙肝的患者中约有25%左右死于与乙型病毒感染相关的肝硬化、肝癌[5]。所以研究阻止乙型肝炎相关性肝癌发生的治疗药物具有重要的意义。中医对于慢性乙型病毒性肝炎早有“胁痛”“酒癖”“酒疸”“酒臌”等认识，在慢性乙肝及乙型肝炎相关性肝癌的治疗中有独特的疗效[6]。健脾活血方能够发挥健脾理气活血的作用，前期研究表明健脾活血方能够明显改善内毒素诱发的大鼠急性肝损伤[7]。但是健脾活血方对乙型肝炎相关性肝癌的治疗作用还不清楚。本研究在LPS处理人肝癌细胞株HepG2的基础上进行健脾活血方治疗，分析健脾活血方对LPS诱导的肝癌细胞迁移、侵袭和EMT的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

Lipopolysaccharide(LPS，Enzo life sciences，浓度1 mg/mL)；Transwell细胞培养板(BD)；matrigel基质胶(BD)；HRP标记的GAPDH优质内参(康诚生物)；Anti- Vimentin、N-cadherin、E-cadherin(Abcam)；HRP标记的Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)(Southern biotech)；显微镜CKX41,U-CTR30-2(Olympus)；拍照系统MC30(广州市明美科技有限公司)；酶标仪multiscan MK3(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 中药健脾活血方制剂血清制备

中药健脾活血方全方制剂按照白术12 g、姜黄8 g、丹参5 g、白芍10 g、泽泻5 g、葛根15 g、枳壳5 g、五味子5 g的配比组成，对实验小鼠采用灌胃的方法，3天共进行6次(每隔12 h一次)，在末次灌胃1 h后从腹腔静脉取血，无菌条件下分离血清，加热灭活备用。生理盐水灌胃小鼠血清作为对照。

1.2.2 细胞培养和处理

人肝癌细胞株HepG2(武汉大学细胞中心)接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，放入饱和湿度、5% CO2、温度为37℃培养箱中培养，24 h后更换培养液，放入培养箱中继续培养，观察细胞的生长状况，待细胞生长状态基本恢复正常后，取对数期细胞进行实验。将对数期HepG2更换培养液并添加LPS(浓度0.1 mg/ml)诱导24 h；然后将LPS诱导的HepG2细胞分为治疗组(添加10%含有健脾活血方药物血清培养，命名为LPS+治疗组)以及空白对照组(添加10%不含健脾活血方药物血清培养，LPS+对照组)，两组持续采用LPS(浓度0.1 mg/ml)处理。正常培养的HepG2(添加10%不含健脾活血方药物血清培养，不添加LPS)作为阴性对照组(命名为HepG2组)。

1.2.3 Transwell迁移和侵袭检测

细胞迁移：收集各处理组细胞，计数1×105个细胞，用100 μl无血清培养基重悬，加入Transwell细胞小室的上室，在下室加入600 μl完全培养基。在37℃、5% CO2的条件下孵育48 h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗涤一次，结晶紫染色10 min，1×PBS洗涤一次，并拍照统计。

细胞侵袭：首先4℃溶解Matrigel过夜，用预冷的无血清培养基以1∶3的体积比稀释Matrigel，取40 μl加入预冷的Transwell小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；其余步骤同细胞迁移。

1.2.4 Western blot检测

处理48 h后离心收集细胞并采用RIPA裂解液加入PMSF混匀，冰上裂解细胞30 min。12 000 rpm离心20 min取上清。BCA法测定蛋白总浓度，12% SDS-PAGE分离总蛋白，每孔上样量为30 μg；然后采用湿转的方式以300 mA转膜30 min，将蛋白转移到PVDF膜；采用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，PBS稀释一抗(anti-N-cadherin：1∶2 000；anti-Vimentin：1∶1 000；anti-E-cadherin：1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；HRP标记的Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(稀释比1∶4 000)室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；于暗室中进行曝光拍照并进行灰度分析。

1.3 数据统计

2 结果

2.1 健脾活血方抑制LPS诱导的HepG2细胞迁移

各组HepG2细胞迁移采用Transwell检测，结果如图1所示。

对迁移结果进行统计分析如表1所示。该结果表明HepG2组、LPS+对照组和LPS+治疗组三组之间差异显著具有统计学意义(P<0.001)。LSD两两分析表明,和HepG2组相比，LPS+对照组中HepG2细胞迁移数显著增多，差异具有统计学意义(P=0.007)；和LPS+对照组相比，LPS+治疗组中HepG2细胞迁移数显著减少，差异具有统计学意义(P<0.001)。

图1 Transwell检测HepG2组、LPS+对照组和LPS+治疗组中迁移HepG2细胞的代表图

表1 各组HepG2细胞的迁移数比较

2.2 健脾活血方抑制LPS诱导的肝癌细胞的侵袭

各组HepG2细胞侵袭采用Transwell检测，HepG2细胞侵袭结果如图2所示。

图2 Transwell检测HepG2组、LPS+对照组和LPS+治疗组中侵袭HepG2细胞的代表图

对侵袭结果进行统计分析如表2所示。该结果表明HepG2组、LPS+对照组和LPS+治疗组三组之间侵袭细胞数差异显著具有统计学意义(P<0.001)。LSD两两检测表明：和HepG2组相比，LPS+对照组中HepG2细胞侵袭数显著增多，差异具有统计学意义(P=0.021)；和LPS+对照组相比，LPS+治疗组中HepG2细胞侵袭数显著减少，差异具有统计学意义(P=0.001)。

表2 各组HepG2细胞的侵袭数比较

2.3 健脾活血方抑制LPS诱导的肝癌细胞的EMT

各处理组EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表达采用Western blot检测，Western blot代表图如图3所示。

图3 Western blot检测N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白的表达

灰度统计结果如表3所示。该结果表明HepG2组、LPS+对照组和LPS+治疗组三组之间N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表达差异都显著，具有统计学意义(P<0.001)。LSD两两检测表明：和HepG2组相比，LPS+对照组中N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著增加，E-cadherin蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P值分别为0.011，0.027，<0.001)；和LPS+对照组相比，LPS+治疗组中N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P值分别为<0.001，0.003，<0.001)。

表3 各组N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表达量比较

3 讨论

LPS在慢性乙型肝炎向肝硬化以及肝癌的发展中发挥重要的作用，有研究表明LPS在慢性重型乙型肝炎组中的表达明显高于慢性乙型肝炎组和对照组[8]。LPS刺激人肝癌细胞和原代鼠肝细胞通过TLR4信号通路能够上调肝癌细胞的增殖以及炎症因子IL-6和IL-8以及TNF-α的表达，还能够通过上调泛素样蛋白酶(ubiquitin-like protease，USP)18损害肝脏先天免疫反应[9-11]。肿瘤的迁移和侵袭会导致肿瘤转移，是肿瘤患者死亡的重要原因之一，而EMT能够使上皮细胞失去细胞极性，获得更高的迁移与侵袭能力。LPS能够刺激炎症细胞来调节肿瘤微环境中细胞因子水平，诱导血管生成，促进肿瘤入侵以及转移[12]。Lai FB等[13]研究表明,LPS能够促进肝癌的迁移和侵袭。本研究发现和正常培养HepG2细胞相比，LPS处理能够显著增加肝癌HepG2细胞的迁移和侵袭(P均<0.05)；同时显著增加Vimentin和N-cadherin蛋白的表达，降低E-cadherin蛋白的表达(P均<0.05)。以上结果表明LPS处理能够促进肝癌HepG2细胞发生EMT、迁移和侵袭，和Lai FB等[13]研究结果类似。

中药健脾活血方由白术、姜黄、丹参、白芍、泽泻、葛根、枳壳和五味子组成。有研究表明中药健脾活血方在治疗肝硬化腹水中能够明显改善临床症状、提高白蛋白，疗效优于常规西医治疗[14]。对于中晚期肝癌患者以TACE化疗联合健脾活血中药治疗能够可延长患者生存时间[15]。但是中药健脾活血方对LPS诱导的HepG2细胞的迁移侵袭作用以及机制还不清楚。本研究结果表明和LPS+对照组相比，健脾活血方治疗能够显著抑制LPS诱导的HepG2细胞的迁移、侵袭(P均<0.05)，降低Vimentin和E-cadherin蛋白的表达(P均<0.05)，促进N-cadherin蛋白的表达(P<0.05)，该结果表明健脾活血方治疗能够阻止LPS诱导的HepG2细胞发生迁移侵袭以及EMT。

总之，LPS处理能够促进肝癌HepG2细胞发生EMT、迁移和侵袭，而健脾活血方治疗能够阻止LPS诱导的HepG2细胞发生转移侵袭以及EMT。但是关于健脾活血方治疗肝癌的临床应用有待进一步研究。

[1] Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] Chen W,Zheng R,Zeng H,et al.Annual report on status of cancer in china,2011[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1):2-12.

[3] Liu Z,Dai X,Wang T,et al.Hepatitis b virus pres1 facilitates hepatocellular carcinoma development by promoting appearance and self-renewal of liver cancer stem cells[J].Cancer Lett,2017,400,149.

[4] Xiong Q,Wu S,Wang J,et al.Hepatitis b virus promotes cancer cell migration by downregulating mir-340-5p expression to induce stat3 overexpression[J].Cell &Bioscience,2017,7(1):16.

[5] Perz JF,Armstrong GL,Farrington LA,et al.The contributions of hepatitis b virus and hepatitis c virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide[J].J Hepatol,2006,45(4):529-538.

[6] Park S,Lim J,Kim JR,et al.Inhibitory effects of resveratrol on hepatitis b virus x-protein (hbx)-induced hepatocellular carcinoma (hcc)[J].J Vet Sci,2017.

[7] 傅琪琳,冯琴,胡义扬,等.健脾活血方抗内毒素诱发大鼠急性肝损伤的主效应中药筛选验证及药理作用环节点分析[J].中华中医药杂志,2012,27(4):779-783.

[8] 程晓宇,张伦理.CD14和Toll样受体4的表达在内毒素致肝炎重型化中的意义[J].中华肝脏病杂志,2010,18(6):428-432.

[9] MacParland SA,Ma XZ,Chen L,et al.Lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha inhibit interferon signaling in hepatocytes by increasing ubiquitin-like protease 18 (usp18) expression[J].J Virol,2016,90(12):5549-5560.

[10] 康玉明,苏国爱,张艳丽.LPS对肝癌细胞TLR4及IL-23/IL17A表达的影响[J].宁夏医学杂志,2017,39(1):6-8.

[11] 刘亚婷,李涛,徐恩君,等.LPS对肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡及分泌炎症因子的影响[J].安徽医科大学学报,2015,50(5):604-607.

[12] Karnevi E,Andersson R,Rosendahl AH.Tumour-educated macrophages display a mixed polarisation and enhance pancreatic cancer cell invasion[J].Immunol Cell Biol,2014,92(6):543-552.

[13] Lai FB,Liu WT,Jing YY,et al.Lipopolysaccharide supports maintaining the stemness of cd133(+) hepatoma cells through activation of the nf-kappab/hif-1alpha pathway[J].Cancer Lett,2016,378(2):131-141.

[14] 刘全忠,张永华,李素领.健脾活血方治疗肝硬化腹水患者30例[J].光明中医,2016,31(12):1759-1761.

[15] 方祯,李伟良,许尤琪.健脾活血中药复方联合TACE治疗肝癌的临床研究分析[J].中国卫生标准管理,2017,33(3):102-104.