SPG复方抗酒精性肝损伤的作用及其急性毒性实验研究

杨春梅，胡源霖，侯俊玲，3，王文全，3，4*，尚迪，施露

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京城市学院生物医药学部，北京 100094；3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102；5.北京中医药大学东方学院，河北 廊坊 065001)

酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)是因长期饮酒导致的肝脏疾病，发病率呈逐年上升的趋势。酒精可引起消化、循环、神经等系统病变，其中肝脏作为酒精代谢的主要器官，受害最为常见[1-3]。ALD初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。中医药在防治酒精性肝病方面标本兼治，在早、中期，多以疏肝清热、化痰利湿、活血祛瘀为主要治疗原则，取得了一定的疗效[4-5]。

SPG复方为本课题组研究方剂，主含丹参、赤芍、甘草等药材，整方配伍体现活血化瘀、疏肝清热、利肝止痛、扶正固本的治疗思路，主要成分均有较多文献报道对各种实验性肝损伤具有改善作用[6-11]。基于前期临床与文献研究，本文以小鼠急性酒精性肝损伤为模型，考察SPG复方对小鼠急性酒精性肝损伤的影响及其口服给药急性毒性,现将结果报告如下。

1 实验材料

1.1 动物

ICR小鼠，体质量18～22 g，雄性，合格证号SYXK(京)2011-0024，购买自维通利华实验动物有限公司。动物房保持通风，干燥，室温22℃～25℃，湿度50%～70%，自由饮水，鼠料定量饲养。饲料由北京中医药大学西区实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂

SPG复方提取物按照本课题组前期研究结果[12]制备，浸膏中指标性成分丹酚酸B、芍药苷及甘草酸转移率分别为61.22%、84.63%、91.25%，分别配制成低、中、高三个剂量的供试液，按照1 ml/20 g体质量灌胃给药。为避免变质，药液均每日灌胃前临用配制。

50%乙醇溶液：无水乙醇，配置成50%浓度(6 g/kg体质量)灌胃;配制10%甲醛溶液；医用生理盐水。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)由自动生化检测仪检测；丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、谷胱甘肽(GSH)采用南京建成生物研究所试剂盒，严格按照说明书操作。

1.3 主要仪器

Sigma 3K15高速冷冻台式离心机(德国赛唯斯科技(北京)有限公司)；SartoriusBP211D电子分析天平(德国赛多利斯集团)；FSH-2型高速匀浆机(江苏常州国华公司)；QL-901涡旋混合器(海门市麒麟医用仪器厂)；BP211D型电子分析天平 (精度：十万分之一，瑞士METFLER- TOLEDO Co.)；XDTD-6000型恒温水浴锅(上海仪器仪表有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.4 统计方法

统计软件采用SPSS 18.0统计软件包分析,统计结果用(mean±SD)表示。组间比较先采用方差分析F检验进行方差齐性检验,方差齐的采用非配对t检验,不齐的采用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 实验方法与结果

2.1 复方对小鼠急性酒精性肝损伤的影响

2.1.1 实验设计与指标测定

60只小鼠随机分为5组，分别为空白对照组、模型组、SPG复方低、中、高剂量组(0.975，1.95，3.9 g/kg)，每组12只。分组后，治疗组均按照10 mL/kg灌胃给药，连续给药10 d，正常组和模型组每天灌胃等量的蒸馏水。末次给药后，除正常对照组外，其余各组动物均按14 mL/kg灌胃50%乙醇，正常组灌胃相当剂量的蒸馏水。造模后禁食不禁水，12 h后摘眼球取血，分离血清，用自动生化分析仪测定血清中ALT、AST的活性。处死小鼠后，立即取肝脏右叶同一部位，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片和染色。另取肝脏200 mg，以零度生理盐水清洗血液后制取肝组织匀浆，按照试剂盒操作说明测定并计算其中MDA、GSH、TG含量。

2.1.2 结果与分析

2.1.2.1 一般情况

小鼠在给药期间无死亡，灌胃给予50%乙醇后出现翻正反射消失、嗜睡等醉酒状态，约2～6 h逐渐苏醒。

2.1.2.2 SPG复方对小鼠血清中ALT和AST活性的影响

小鼠血清ALT和AST活性统计结果见表1。与模型组相比，SPG高、中剂量组对血清ALT、AST水平的降低作用显著(P<0.01、P<0.05)，低剂量组无差异。模型组与空白对照组在肝脏颜色、形态及血清ALT与AST活性方面的差异表明，小鼠一次暴饮50%乙醇的急性酒精性肝损伤模型成功，SPG水提物中、高剂量组可抑制肝损伤小鼠血清中ALT与AST活性的升高。

表1 各组血清ALT和AST活性比较

注：与空白对照组相比，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05，dP<0.01

2.1.2.3 SPG复方对小鼠肝组织中GSH、MDA、TG含量的影响 见表2。

表2 各组肝组织匀浆中GSH、MDA、TG的含量对比

注：与空白对照组相比，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05

表2中各指标统计结果表明，与空白对照组相比，模型组小鼠肝组织匀浆中GSH水平显著降低(P<0.01)，MDA与TG含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，SPG中、高剂量组对升高GSH水平、降低MDA水平有显著性差异(P<0.05)，低剂量组对两指标均无显著性影响；SPG高剂量组对降低TG水平有显著性差异(P<0.05)，中、低剂量组对TG的含量没有呈现出显著的降低作用。

2.1.2.4 SPG复方对肝组织病理变化的影响

对酒精性肝损伤小鼠肝组织进行HE染色及组织形态学观察，结果如图1所示。结果表明，正常组小鼠肝小叶结构清楚，肝索呈放射状排列清晰，肝细胞结构正常；模型组小鼠局部肝细胞变性，细胞核增大，肝血窦轻度扩张，中央静脉结构大致正常，肝细胞多边形，体积轻度变小，细胞核略大小不一、染色质深浅不等；SPG复方低剂量组肝细胞轻度变性，肝组织结构基本完整；SPG复方中、高剂量组肝小叶排列整齐，肝索放射状排列，肝血窦及中央静脉结构大致正常，肝细胞未见变性、坏死及炎细胞浸润。

图1 SPG复方对酒精性肝损伤小鼠肝组织的影响(HE染色，×40)注:1:正常对照组；2:模型对照组；3:SPG低剂量组；4:SPG中剂量组；5:SPG高剂量组

2.2 复方急性毒性实验

2.2.1 实验设计原理

急性毒性研究常用方法有近似致死剂量法、最大给药量法(MLD)、上下法(阶梯法)、最大耐受剂量(MTD)法、半数致死量法(LD50)等。前期预实验以单位体积溶解或混悬最大浓度复方浸提物、并能通过小鼠灌胃12#针头为准进行配液，得到最大给药浓度为0.4 g/mL，并推算出日最大给药剂量。参照毒性实验方法[13]MTD和LD50无法测出，所以仍以MLD观察小鼠在最大给药浓度及给药体积下的生理状态，并依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》进行设计[14]。

2.2.2 实验分组

采用最大给药量试验法。选体质量 18～22 g的ICR小鼠共50只， 雌雄各半。实验共分3组，分别为正常对照组(10只小鼠，雌雄各半)、每日1次给药组、每日2次给药组，两给药组每组20只小鼠，雌雄各半。试验前动物禁食16 h，不限饮水。两个给药组分别于第一天灌胃给予0.4 g/mL(相当于2 g生药)的SPG复方水提物1次和2次，灌胃最大给药容积为0.4 ml/(10 g·BW)；正常组灌胃给予相同体积量的蒸馏水。灌胃后观察观察14 d，每周称重2次。

2.2.3 指标统计

灌胃后开始记录小鼠行为活动、食物摄取、饮水、体质量、外观、分泌物、死亡情况等。试验结束处死小鼠并进行大体解剖， 肉眼观察肝、心、脾、肺、肾、胃、肠(大肠、小肠)的质地、体积、颜色是否发生变化，如有死亡或解剖发现异常病变，则对改变的器官进行组织形态学检查。

2.2.4 SPG复方急性经口毒性试验结果

2.2.4.1 小鼠体质量变化趋势正常

以最大给药量的样品给予小鼠灌胃后，未见动物有中毒症状，无动物死亡，试验结束后通过脱颈处死动物并进行解剖，肉眼观察未见心、肝、脾、肺、肾、胃、肠(大肠、小肠)有异常，体质量变化趋势符合小鼠基本生长规律，未出现体质量明显增加和减少的情况，结果见表3。从以上指标观察认为，本复方对小鼠经口给药的急性毒性级别基本无毒。

表3 小鼠体质量变化表

2.2.4.2 复方水提物小鼠灌胃给药MLD值

本次试验结果表明，SPG复方浸提物以最大浓度、最大体积灌胃一次，观察14日，未引起小鼠死亡，亦未影响其生长和行为活动，摄食、饮水、大小便及解剖学检查等未发生异常。以最大浓度、最大体积灌胃给药2次，在体质量及生理活动状态方面仍然未发现与正常组相比有异常的情况。按照最大给药剂量0.4 g/mL(2 g生药量)给药量、最大给药体积0.4 ml/(10 g·BW)，则小鼠实际给药量为80 000 mg/(kg·BW)生药材。此用药剂量与临床人用量相比，每日1次相当于人用量的228倍，每日给药2次则相当于人用量的456倍。小鼠对SPG复方的每日最大给药量按生药材计MLD>160 g/kg。

3 讨论

氧化应激被认为是酒精性肝病的一个重要的致病因素[15]。机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下大量脱氢氧化，使三羧循环障碍和脂肪酸氧化减弱，影响脂肪代谢，致α-磷酸甘油增多而促进甘油三酯(TG)合成。由肝细胞代谢产生乙醛并继续代谢产生乙酸的过程同时产生了大量的还原型辅酶Ⅰ(NADH)，增加了呼吸链中传递的电子流，导致活性氧(ROS)过度产生[16-19]。乙醇通过激活氧分子，产生氧自由基造成肝细胞膜的脂质过氧化、体内还原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭，破坏肝细胞膜，引起肝内脂肪沉积，引起肝脏和机体其他器官系统的炎症反应。

SPG复方中、高剂量组对肝损伤小鼠血清中ALT和AST的升高有显著抑制作用，并可显著升高GSH水平、降低MDA水平，高剂量组对TG的水平有显著降低作用，病理特征与对照组相比有明显改善，显示了对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。急毒结果说明,SPG复方口服剂量低毒安全，为进一步研究开发奠定基础。复方的保肝效果可能与其抗氧化作用有关，机制有待进一步研究。

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