毛脉酸模内生真菌促生作用的初步研究

李佳宾，丁常宏，张爽，郭慧，崔红花，王振月*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

内生真菌是指植物在其生命周期的各个时段体内所包含的定植在宿主活体组织中并且不使宿主产生任何病症的真菌[1]。植物界中的所有植物几乎都含有内生真菌。在相互作用的漫长过程中，内生真菌与植物形成共生关系，植物为真菌供应生存的环境和营养物质，内生真菌产生植物激素增进植物生长和组织分化，还可以通过制造营养素和与病原菌竞争来保护植物[2]。近些年来，有许多学者对内生真菌的促生作用进行了研究。Abdur Rahim Khan等[3]研究了龙葵内生真菌培养液对其生长的影响，显著提高了其生物量;陈贝贝等[4]发现一株促进地黄生长的内生真菌;刘慧等[5]的研究也证明内生真菌对宿主生长有较大影响。毛脉酸模为蓼科酸模属多年生草本植物，在民间以根入药，对淋病、上呼吸道感染、癣病和疮毒有确切疗效[6]，其根中含有酸模素、大黄酚、大黄素、白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素甲醚等多种有效成分[7]，具有重要的应用和研究价值。本实验研究内生真菌对毛脉酸模的作用，获得有促生作用的内生真菌，为毛脉酸模栽培技术的研究提供参考，为内生真菌的应用与开发提供借鉴。

1 材料

毛脉酸模种子，取自黑龙江中医药大学药用植物园。毛脉酸模内生真菌，由丁常宏博士分离获得。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L；无菌苗培养基：MS，蔗糖30 g，琼脂9 g，水1 L，pH值6；共生培养基：同无菌苗培养基。

2 方法

2.1 内生真菌的培养

将内生真菌接种于PDA培养基上进行活化，28℃暗培养一周。

2.2 毛脉酸模无菌苗的制备

参考谢彦梅等[8]的方法，对种子进行处理，接种种子于无菌苗培养基上，在培养温度(昼/夜)25/18℃、光照周期14/10 h、光强3 000 Lx的条件下培养，至种苗长出3片真叶。

2.3 共生培养

选取长势一致的无菌苗接种至含有共生培养基的培养皿中，每个培养皿接种一株，5天后挑取内生真菌菌丝接种在距离无菌苗2 cm处，3个重复，置于培养温度(昼/夜)25℃/18℃、光照周期14/10 h、光强3 000 Lx的条件下培养25天。

2.4 筛选促进毛脉酸模生长的共生体系

共培养结束后，观察植株形态，区分出促进生长的共培养体系，抑制生长的共培养体系和无明显作用的共培养体系。

2.5 植物生理指标测定

从有促进作用的共培养体系中将苗从培养皿中取出，小心洗去附着在根部的培养基和菌丝，吸干水分后，测量株高，称量鲜重，烘干至恒重后，称量干重。

2.6 促生长内生真菌的鉴定

根据培养基菌落特征和内生真菌的显微形态特征，参照文献[9-10]进行形态鉴定，确定到属。

3 结果与分析

3.1 促进毛脉酸模生长的内生真菌

内生真菌与毛脉酸模无菌苗共培养之后，有5个菌株(G-A、G-C、G-D、J-B、J-G)具有促生长作用，叶片宽大肥厚，见图1；2株内生真菌对种苗没有明显的促进和抑制(Y-B，Y-A-1)，见图2；10株内生真菌对毛脉酸模有不同程度的抑制作用，植物表现出一定的致病性，枯萎、矮小、黄化等(G-B、Y-E、J-3、J-A、J-C、J-F、Y-2、Y-A-2、Y-C、Y-D)，见图3。

图1 内生真菌促进毛脉酸模生长的共生组和对照组

图2 内生真菌无明显促进和抑制作用的共生组和对照组

图3 内生真菌抑制毛脉酸模生长的共生组和对照组

值得注意的是Y-A-2、J-A、J-3这3株菌在共生的前期种苗生长状态优于对照组，共生时间超过20天后出现叶片枯萎、植株矮小的状况。这说明植物和内生真菌的关系并非一成不变的，随着环境的变化，有益的共生可能转变为有害的寄生。

具有促生作用的内生真菌有5株，接种这5种内生真菌的毛脉酸模种苗的生长指标见表1，对株高，地上鲜重、干重，根部鲜重、干重有不同程度的正面影响。单因素方差分析表明，与对照相比，5个菌株均能增加毛脉酸模的株高，其中J-G菌株能显著增加株高，比对照提高了21.9%。在根鲜重方面，5个菌株对毛脉酸模根鲜重都有提高，其中G-A、J-G、G-D、G-C的促进作用均达显著水平，分别比对照增加了134.3%，173.0%，271.3%，156.2%。在根干重方面，G-A和G-C可以显著增加根的干重，分别增加139.9%和116.7%，其余菌株对毛脉酸模干重也有不同程度的增加。对地上部分的干重和鲜重，5个菌株对毛脉酸模均有促进作用，但未达到显著水平。

接种不同的菌株对毛脉酸模的影响也不一样，G-A对测定的5个指标均有正面影响，在根鲜重和干重方面达到显著水平。J-G对株高和根鲜重的影响显著，J-B对毛脉酸模各方面均有提高，但并不显著。G-D对株高和根的鲜重和干重均有促进作用，对根鲜重促进作用显著，但对地上部分的鲜重和干重几乎没有影响。G-C作用与G-A相似都显著增加了根的鲜重和干重，对其他方面有促进作用但并不显著。

毛脉酸模的根是其主要药用部位，所以菌株G-A和G-C对根部生长的促进作用具有重要的意义。

表1 内生真菌对毛脉酸模的促生作用

注：与CK比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 促生长内生真菌的鉴定

经菌落形态和显微观察，参照文献[9-10]鉴定得出，5株内生真菌分属于3目，4科，5属。结果见表2。

表2 内生真菌鉴定结果

4 讨论

本实验从分离的17种内生真菌中筛选出5种具有不同促生作用的内生真菌，分析了其促生作用，并对其种属进行了鉴定，这5种内生真菌分别来自于丝核孢属、小尾孢属、齿痕霉属、长蠕孢属、木霉属。这与胡凤[11]等对毛脉酸模内生真菌的分离结果相似。G-A、G-C、G-D都分离自毛脉酸模活体植株的根部，J-B、J-G分离自毛脉酸模的茎，毛脉酸模内生真菌的促生作用可能是其侵入植物体后与之形成菌根结构[12]，或者内生真菌产生了促进植物生长的次生代谢物[13]。部分菌种在与植株共生过程中出现前后促生效果不一致的现象，因为两者之间的相互作用关系发生了改变，互惠共生是植物的防卫反应和内生菌的营养需求间的复杂的平衡，营养物交换的不平衡是大多数共生到寄生转变的特点[2]。随着真菌的生长，大量在植物体内定植，营养需求增多，对幼苗的生长造成太大压力，两者之间的平衡被打破，出现由共生到寄生的转变。不同的内生真菌对宿主的促生作用不同，促进植物生长的部位和程度也不同，侯小强[14]等就筛选出8株对铁皮石斛有不同促生作用的内生真菌。根据不同内生真菌的不同促生效果，可以对其进行分类利用。从药用部位方面来说，促进毛脉酸模根部生长的内生真菌具有较大价值。

本实验只对毛脉酸模生物量进行了测定，植物内部理化性质的改变尚不明确，我们将在随后的工作中对此进行相关研究。

因为很难模拟植物体内环境，所以植物的内生真菌难以全部分离[15]，因此，毛脉酸模植物体内可能存在着许多未知的具有促生作用的内生真菌。这些内生真菌可以缩短毛脉酸模生长周期，增加毛脉酸模中药资源，具有重要实用价值。所以，对于内生真菌促进植物生长的特性的研究和共生技术的获得具有重要的意义。

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