提高阳和汤质量标准研究

窦建卫，尚荣国，彭湃，黄芊，朱宇红*

(1.西安交通大学药学院，陕西 西安 710061；2.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；3.西安市中医医院，陕西 西安 710004)

阳和汤由熟地黄、甘草、麻黄、白芥子等中药组成，具有温阳散寒、补血通滞之效。前期研究表明，阳和汤对乳腺癌细胞内多种信号通路蛋白可起到抑制作用，对乳腺癌具有良好的控制作用，且药物安全性良好[1-3]。课题组前期对阳和汤中的肉桂、麻黄、白芥子、土贝母进行了质量控制研究，为了进一步控制其质量，我们分别采用薄层色谱法和高效液相色谱法对其质量标准进行研究,内容如下。

1 仪器与设备

1.1 仪器

超声波清洗机(型号：PS-40，深华泰超声洗净设备有限公司)；分析天平(型号：YP1201N，上海天平仪器厂)；0.1 mg微量分析天平(型号：FA1104，上海天平仪器厂)；0.01 mg微量分析天平(型号：AB135-S，梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

芥子碱硫氰酸盐对照品(批号111702-201605)；甘草对照药材(批号120904-201519)；毛蕊花糖苷对照品(批号111530-201512)；供试品、阴性样品均为自制；其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 熟地黄

取样品适量(约5 mL)，加入一定量甲醇溶液(约50 mL)，超声0.5 h，滤过，收集甲醇相并蒸干，得残渣，再加水溶液6 mL溶解，加正丁醇萃取分离(3次)，每次用量10 mL，合并有机相，蒸干，得残渣，再加甲醇溶液2 mL溶解，为供试品溶液[4]。同时，取一定量毛蕊花糖苷对照品，甲醇溶解，配制对照品溶液。按照处方的构成比，取不含熟地黄的其余药材，用同样的方法制成不含该成分的阴性样品溶液。依薄层色谱法(通则0502)[5]，取以上溶液各10 μL，分别点于硅胶G薄层板的同一水平线上，将其放入展开剂中片刻，拿出，晾干后，浸渍于0.1%的2,2-二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液中，取出晾干。展开剂按照乙酸乙酯-甲醇-甲酸试液体积比为17∶1∶2配制而成。结果显示，供试品与对照品色谱相比在相应的位置上，主斑点显相同形状、颜色，随行阴性显示无干扰，因此将此方法列入标准正文。

2.2 甘草

取适量样品(约5 mL)，加甲醇溶液约40 mL，加热回流1.5 h，过滤，收集有机相并蒸干，得残渣，再加水溶液20 mL溶解，加正丁醇萃取分离(3次)，每次用量10 mL，合并有机相，蒸干，得残渣，再加甲醇溶液2 mL溶解，为供试品溶液[6]。同时将甘草对照药材，按以上方法配制成对照品溶液。按处方的构成比，取不含甘草的其余药材，用同样的方法制成不含甘草的阴性样品溶液。取以上溶液各5 μL,各自点到硅胶G薄层板的同一水平线上，放入展开剂中片刻，拿出后，晾干，将10%硫酸乙醇喷于薄层板上,105℃条件下加热，斑点完全显现时停止。展开剂按照醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水体积比为14∶1∶1∶2配制而成。供试品与对照品色谱相比，在相应的位置上，主斑点显相同形状、颜色，随行阴性显示无干扰，因此将此方法列入标准正文。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(14∶86)；检测波长326 nm。按芥子碱峰计算理论板数应≥3 000。

3.2 对照品溶液的制备

取一定量芥子碱硫氰酸盐，用甲醇溶液配制成浓度为150 μg/mL的溶液，为对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

精确量取样品10 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声处理1.5 h，稍冷，补加甲醇溶液至刻度线，混匀，过滤，收集续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备

按3.3制备方法，取除白芥子外的阴性样品适量，制备阴性对照溶液。

3.5 干扰性试验

精确量取对照品溶液10 μL，进行检测，获得色谱图，供试品和阴性对照溶液重复上述步骤。结果可知，在色谱峰相对应的位置上，阴性样品无色谱峰被检出，说明制剂中其他药材不会干扰芥子碱硫氰酸盐的测定。结果如图1～3。

图1 芥子碱硫氰酸盐对照品HPLC图

图2 样品HPLC图

图3 阴性对照样品HPLC图

3.6 线性考察

称取一定量芥子碱硫氰酸盐对照品，用甲醇溶液作为溶剂，制备为浓度为41.0、60.0、82.0、205.0、410.0 μg/mL的溶液，定量吸取上述溶液20 μL进行实验，获得色谱图及峰面积积分值，分析得到其回归方程：y=1 693.3x-86.614(r=0.999 2)，在0.82～8.2 μg范围内，芥子碱硫氰酸盐与峰面积有较好的线性关系。

3.7 精密度试验

取对照品溶液，进行实验(色谱条件如上)，获得色谱图，色谱峰面积，以芥子碱硫氰酸盐峰面积进行考察，重复进样6次，计算RSD等于0.75%。结果可知，该方法精密度良好。

3.8 稳定性试验

在0 h开始，每隔2 h进样一次，共进样5次，每次10 μL，获得色谱图，同时测定色谱峰面积，RSD等于0.72%。结果可知，在8 h内供试品溶液稳定性良好。

3.9 重复性试验

按以上方法制备供试品溶液6样份，顺次分别取10 μL进行分析，获得色谱图，计算其中芥子碱硫氰酸盐的含量为0.436 mg/mL，RSD=0.98%。结果可知，此种方法有很好的重复性。

3.10 加样回收率试验

取一定量已知浓度的样品，各1 mL，依次分别加入容量瓶中，分别加以上芥子碱硫氰酸盐(浓度：0.415 mg/mL)对照品溶液1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL，依以上方法制备、分析，获得色谱图，计算样品中芥子碱硫氰酸盐含量、回收率，结果见表1。

表1 样品的回收率试验结果

3.11 样品的含量测定

按以上方法对3批阳和汤进行含量测定，芥子碱硫氰酸盐平均含量为0.445 mg/mL。

4 讨论

阳和汤作为临床常用中药复方制剂，由熟地黄、甘草、麻黄、白芥子等组成。其中熟地黄为滋养之品，滋阴补肾，养血调肝；麻黄、肉桂、炮姜炭、白芥子乃温阳之药，具有驱散寒邪，腠理开，寒凝解，气血则行，毒迹随消。肉桂、炮姜炭入血分，温经散结而解寒凝；麻黄辛温，得熟地黄而通络[7]；白芥子通阳散寒而消痰结，祛内外之痰。诸药配伍，针对阳气亏虚之本，寒凝痰滞之标，温阳共补阴合用，滋腻和辛散相伍，温且不燥、补而不腻。寒邪易客于肌肉、筋骨，凝则为痰，凝痰阻碍气血运行，日久为瘀血，寒痰瘀聚于乳，则为“乳岩”，本方温阳化寒痰而解凝聚，血得阳气而行，寒痰得阳气而消，则痰瘀肿块之乳岩可除。

前期研究表明，在体外作用方面，阳和汤可抑制MDA-MB-231细胞的增殖，下调NF-κB 的表达、减少IL-8的分泌，从而有效阻止乳腺癌的发生、发展[2]；在体内作用方面，阳和汤可通过降低血清中IL-6、肿瘤组织中MMP-9，以及降低组织中CD90的表达，显著抑制裸鼠移植瘤的生长、增殖及转移[1,3]。临床观察表明，阳和汤能有效控制乳腺癌的发生发展，具有较高的安全性。因此为了进一步控制阳和汤的质量，更好的应用于临床和实验研究，我们建立了阳和汤中芥子碱硫氰酸盐的含量测定方法。此外，我们对其中熟地黄、甘草进行薄层色谱鉴别研究，在相应展开系统下的供试品色谱中，能特征性地鉴别出制剂中熟地黄、甘草，以便有效地控制阳和汤的质量，更好的应用于临床与实验研究。

[1] 窦建卫,任翠翠,郝云,等.阳和汤对裸鼠荷人乳腺癌组织中CD90表达的影响及其抑瘤作用[J].世界中医药,2015,10(3):391-393.

[2] 窦建卫,黄芊,赵天一,等.阳和汤对乳腺癌MDA-MB-231细胞NF-κB、IL-8表达的影响[J].四川中医,2017,35(2):44-47.

[3] 窦建卫,黄芊,赵天一,等.阳和汤对三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤生长及IL-6、MMP-9表达的影响[J].中国现代医药杂志,2016,18(12):1-4.

[4] 陈遥,汪翔,汪涛,等.玉女煎颗粒剂质量标准研究[J].中国药师,2014,17(9):1460-1463.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.北京:中国医药科技出版社,2015:57-59．

[6] 王芳,王四旺,姚敏娜,等.菊藤胶囊制备工艺及质量标准研究[J].西北药学杂志,2017,32(4):416-420.

[7] 窦建卫,郝云,杨亦奇,等.阳和汤治疗乳腺癌理论发微[J].世界中医药,2015,10(2):196-198.