柴胡-白芍药对干预大鼠抑郁症模型的血清代谢组学研究

张洪财，陈雁雁，王文姌，付新

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学药附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

抑郁症是一种以长期情绪低落为特征的精神类疾病。表现特征为睡眠困难、兴趣丧失、食欲降低、情绪不稳定,具有发病率高、致残率高、治愈率低、复发率高的特点[1-2]。据世界卫生组织统计，抑郁症在全球世界疾病负担中排名第二。目前，临床治疗抑郁症化学药物主要有万拉法辛、氟西汀、米氮平、舍曲林、艾司西酞普兰、瑞博西丁。西药特点为种类繁多、临床应用早、效果显著,但是毒副作用较大，患者依从性差[3-4]。中医药治疗抑郁症疗效较好，且毒副作用相对较小，成为众多学者研究的焦点[5]。文献报道柴胡、白芍、柴胡-白芍药对均具有抗抑郁作用，且柴胡-白芍药对是众多方剂中经典药对。本课题组以CUMS抑郁大鼠模型为对象进行药效学实验，验证其具有抗抑郁作用，但作用机制需进一步深入研究。基于此，本实验利用代谢组学技术研究CUMS抑郁大鼠血清代谢轮廓信息，寻找抑郁症关联的生物标志物，探索代谢途径和作用靶点，阐述作用机制。

1 实验仪器与材料

UPLC-Q-TOF/MS超高效液相色谱串联质谱(美国Waters)；MassLynx 4.1质谱软件(美国Waters)；XZ-25K高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多)；TGL-16G低速离心机(上海安亭仪器有限公司)；KQ-300DE数控超声清洗器(上海凌科实业发展有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海和呈仪器制造有限公司)。

甲醇、乙腈(色谱HPLC级，迪马科技)；色氨酸(65-46-3)、胆酸(81-25-4)、苯丙氨酸(89-18-7)对照品(上海科顺生物科技有限公司)；溶血磷脂酰胆碱(190025)对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司)；尿酸(69-93-2)对照品(上海远慕生物科技有限公司)；SCIENTZ-18ND型冷冻干燥机(宁波新芝冻干设备股份有限公司)。

健康SD大鼠，体质量190～210 g，购自黑龙江中医药大学GLP中心，实验动物生产许可证号：SCX2013-004，实验动物使用许可证：SYK2013-012。

柴胡、白芍药材购于哈尔滨世一堂中草药专营店。

2 实验方法

2.1 提取物的制备

按照柴胡、白芍药材质量1:1组成，水煎煮40 min，煎煮2次，合并水煎液，冷冻干燥，制成粉末备用。

2.2 模型的建立[6-8]

将禁食(24 h)、 夹尾(1 min)、间歇噪音刺激(85 dB)、电击足底(电流强度10 mA，每隔1 min刺激1次，每次持续10 s，共30次)、断水(24 h)、摇晃(1次/s，15 min)、45℃环境热刺激(5 min)、昼夜颠倒(24 h)、4℃冷水游泳(5 min)，陌生气味等10种应激因子按随机方法在28天内应用，为避免大鼠对刺激产生适应性，使大鼠不能预料刺激的发生，每日给予1种刺激。每种刺激累计使用2～3次。

2.3 血清样品的制备

造模3周后，正常组：正常饲养，不接受刺激，每日灌服蒸馏水4.5 ml/kg；模型组：每日灌服蒸馏水4.5 ml/kg；药对组：每日灌服药对溶液4.5 ml/kg，生药量5.9 g/(kg·d)，相当于70 kg体质量成人临床用药的等效量，从实验第一天到实验结束，连续28天；氟西汀组：盐酸氟西汀溶液4.5 ml/kg，生药量1.8 mg/(kg·d )，相当于70 kg体质量成人临床用药的等效量，从实验第一天到实验结束，连续28天。以上各组按程序给予不同应激刺激，给药治疗4周后，采血前12 h禁食不禁水，眼眶采血，离心，样品低温(-70℃)保存，待测。

2.4 液相方法

AcquityTMUPLC液相色谱仪(四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱)；ACQUITY UPLCTMHSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)色谱柱；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙睛；柱温45℃；样品仓温度4℃；流速0.5 mL/min；进样体积：2 μL。最佳梯度洗脱条件见表1。

表1 UPLC梯度洗脱方法

注：A:0.1%甲酸水；B:0.1%乙睛水

2.5 质谱方法

电喷雾离子源(ESI；毛细管电压2.5 kV；样品锥孔电压45 V；提取锥孔电压4.0 V；脱溶剂气温度300℃；脱溶剂气流量500 L/h；锁定质量溶液：采用美国Waters集团公司独家专利Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肤(leueine-enkephalin,[M+H]-=556.277 1,[M-H]-=554.261 5)，锁定质量溶液浓度为200 pg/ml；质量扫描范围:数据平均超过10个扫描，扫描范围m/z 50～900 Da，以centriod模式进行数据采集；工作站:Masslynx V4.1工作站。

3 实验结果

3.1 大鼠行为学指标

评价模型是否成功的指标是糖水偏爱率和摄食量。刺激6周后，模型组显著低于空白组，说明模型建立成功。药对组和氟西汀组优于模型组，但与空白组比较无明显差异。结果见表2。

表2 各组大鼠糖水偏爱率和摄食量实验结果比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 血液样品UPLC-HDMS分析方法的建立

建立了适合大鼠血液样品的UPLC-HDMS分析方法，为全面、高效、准确地检测大鼠血液中内源性代谢物提供保证。色谱图见图1。

图1 血液样品典型UPLC-HDMS色谱图

3.3 对血清代谢物谱的干预作用研究

采用非监督主成分分析(PCA)方法，对空白组、模型组及给药组大鼠血液的代谢指纹数据进行分析，绘制出反映组间离散程度的Score plot(图2)。模型大鼠血液代谢物组发生了明显的变化，与空白组相比明显分类。模型大鼠给予柴胡-白芍药对治疗后，在Score plot上显示出一个独立的表征区域并且向空白组靠近，表明柴胡白芍药对对模型大鼠代谢物组的变化具有回调作用。

图2 大鼠血液代谢数据的PCA分析的Score plot图和Loading-plot图注：a:模型组；b:药对组；c:空白组

3.4 代谢谱中生物标识物的鉴定

各组大鼠血清代谢物谱经PCA处理，利用载荷矢量图找到贡献较大的代谢物，经代谢物一、二级质谱信息及对照品比对，共鉴定出5个对分类贡献较大的代谢物。结果见表3。

表3 血清代谢物相关生物标志物

图3 抑郁模型组与氟西汀组OPLS-DA图注：S模型组；J：氟西汀组

图4 抑郁模型组与药对组OPLS-DA图注：S模型组；Y：药对组

4 讨论

单胺类神经递质学说抑郁症的病理机制之一。色氨酸含量决定5-羟色胺的合成，色氨酸的竞争性氨基酸是苯丙氨酸，柴胡-白芍药对能明显增加色氨酸的浓度，使苯丙氨酸浓度降低，5-羟色胺含量增加，改善抑郁状态；胆酸是胆汁酸成分之一，能够使脂类消化与吸收增强，参与肝肠循环，胆酸在血清中浓度增加，表明脂类物质吸收与代谢出现异常情况[8]。药对能够降低胆酸浓度，调控脂类代谢起到治疗效果；LPC与氧化应激有关。模型组中血清饱和LPC浓度下降，不饱和LPC浓度含量增加，表明LCAT酶活性降低。且尿酸是非酶抗氧化剂，能清除过氧化物，清除自由基，药对能够提高尿酸浓度，抗氧化反应，并能提高血清中饱和LPC浓度。

本实验以抑郁症模型大鼠为研究对象，用糖水偏爱率及摄食量两个实验指标作为模型成功标准。建立模型成功后，应用UPLC/Q-TOF-MS技术分析血清代谢谱，通过PCA主成分分析，发现血清中色氨酸、尿酸、胆酸、溶血磷脂酞胆碱发生明显变化。基于以上内容，推测柴胡-白芍药对抗抑郁机制可能是通过调节氧化应激，脂类代谢、神经递质作用来实现的。

[1] 石志红,石志福,王志勇.抑郁症的国内外研究进展[J].中国民族医药杂志,2014,20(4):58-61.

[2] 孟根花,李浩军.抑郁症的治疗进展[J].中国民族医药杂志,2016,22(12):75-76.

[3] 奚耕思,张武会.抑郁症发生机制研究进展[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2011,39(6):64-71.

[4] 程博琳,方晓艳,苗明三.抑郁症的分子机制及中医药治疗抑郁症特点[J].中医学报,2014,29(2):212-214.

[5] 许二平,许国防,苗明三,等.中医药治疗抑郁症研究进展[J].中医学报,2017,32(1):45-48.

[6] 麦提喀斯木·尼扎木丁,麦合苏木·艾克木,买吾拉尼江·依孜布拉,等.基于NMR代谢组学方法研究异常黑胆质成熟剂对抑郁症大鼠血浆代谢的影响[J].新疆医科大学学报,2016,39(1):1-6.

[7] 杨培,李雪春,林龙飞,等.基于代谢组学技术的白金胶囊治疗抑郁症的研究[J].世界中医药,2014,9(10):1341-1345.

[8] Sontrop J,Campbell MK.Omega-3 polyunsaturated fatty acids and depression: a review of the evidence and a methodological critique[J].Prev Med,2006,42(1):4-13.