真菌性角膜炎诊断学的研究进展

郭 楠,韩 雪，陆成伟,刘秀芬,郝继龙

(吉林大学第一医院 眼科中心，吉林 长春130021)

真菌性角膜炎是一种严重损害视力的眼科疾病，常在角膜外伤、角膜手术后、慢性眼表疾病、皮质类固醇激素局部应用、或佩戴隐形眼镜等条件下发生，其感染源可为丝状真菌或酵母菌等。临床表现为角膜边缘羽状浸润，伴或不伴表面隆起，角膜上皮可完整但存在深基质浸润、卫星灶、内皮斑等，抗生素治疗无效或皮质类固醇激素治疗后病情恶化等均可提示真菌性角膜炎。包括角膜病灶样本涂片镜检及培养在内的微生物学诊断方法仍是诊断的金标准，近年来发展迅猛的分子诊断学方法也逐渐地应用于真菌性角膜炎的诊断，为早期诊断及治疗争取了宝贵的时机。

目前已知的可致真菌性角膜炎的病原菌有56个菌属，105种真菌[1]。由于早期真菌性角膜炎患者有彻底治愈的可能，因此对于疑似真菌性角膜炎患者，临床工作者应尽早明确诊断[2]。除结合临床特征性表现外，包括涂片镜检、培养基培养等传统微生物鉴定方法仍为真菌性角膜炎诊断的金标准。近年来，分子生物学诊断方法发展迅速，为真菌性角膜炎的诊断提供了新的方向，也使早期诊断、早期治疗得以实现。以下将传统及新兴诊断手段均做简要阐述。

1 传统检查手段

1.1 角膜组织涂片检查

角膜组织涂片检查可通过观察镜下真菌菌丝或孢子形态特征来初步诊断真菌性角膜炎。常用染色方法包括10%KOH湿片法、革兰染色法及姬姆萨染色法等[3]。KOH湿片法快速而廉价，是涂片检查最常用的方法之一，它用于检测真菌的灵敏度为61-94%，特异性为99.7%。此外，革兰染色的敏感性在36-50%之间。乳酸酚棉兰染色敏感性为85%，特异性为90%[4]。角膜组织涂片检查简便、快速、廉价，对于真菌性角膜炎高发、检查技术及设备相对落后的国家及地区，不失为一种价值较高的诊断方法。但真菌感染灶通常位于深层基质中，易受取材方法及部位的影响，导致角膜刮除样本中病原体含量较低，使漏诊率明显增加。此外，检查人员的主观性差异，也对检查结果有一定影响[5]。

1.2 真菌培养法

在严重的真菌性角膜溃疡和疑似真菌性角膜炎病例中，真菌培养仍是必要的诊断步骤。最常见的培养基为沙堡弱(Sabouraud dextrose agar,SDA)培养基、血琼脂(BA)培养基，非首诊真菌性角膜炎真菌培养法的阳性率为58%[6]。酵母菌培养周期在24-48 h，而丝状真菌培养周期平均在2-4 d，某些真菌培养周期可能较长(1wk-3wk)，如镰刀菌等。真菌培养具有高度专一性，培养结果阳性仍是诊断的金标准[3]。但缺点是培养周期较长，敏感性较低，导致诊断延迟、错过了最佳治疗时机、增加了手术几率。此外，若在标本获取前，患者已接受了经验性的治疗，可导致假阴性结果的出现[7]。活体共聚焦显微镜(in vivo confocal microscopy,IVCM)活体共聚焦显微镜可在显微结构水平上对角膜组织进行实时成像，分辨率为1微米，可检测到体积为数微米或更大的微生物有机体，如真菌菌丝等[8]。目前有研究表明，针对真菌性角膜炎患者，活体共聚焦显微镜敏感性约94%[9]。IVCM检查的优点包括无创、可于早期对真菌性角膜炎进行诊断、感染深度的确定、治疗效果的评估与指导等。但这项检查要求检查人员具备丰富的检查经验；患者配合度不佳及运动伪影均会影响检查结果；致密的角膜浸润灶或疤痕也会影响组织的渗透性和可视性[10]。此外，IVCM无法检测体积较小的生物体。同时，这项技术的成本相对较高，在经济条件较差的地区，其普及应用收到了限制，许多医疗机构很难获得足够的经验来使用共焦显微镜。

2 分子诊断学

2.1 PCR相关技术

2.1.1聚合酶链反应 ( Polymerase Chain Reaction,PCR)

聚合酶链反应是一种能将特定的DNA片段放大扩增的分子生物学技术手段，可在生物体外的对DNA进行复制，将微量的DNA样本大幅增加。由于PCR技术可在体外对待测基因进行成倍的扩增，目前正在越来越多地应用于病原体感染的早期诊断[11]。相较于真菌性角膜炎传统诊断方法而言，PCR技术具有反应迅速、所需临床样本量小的优势。但是在利用PCR技术对致病性DNA进行扩增的同时，也可对非致病性DNA进行扩增，则会导致过度诊断发生[12]。

2.1.2多重PCR (multiplex PCR)

多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，是一种在同一PCR反应体系内加上二对或二对以上引物，以同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同，但可产生多个PCR产物，用于多种病原菌的同时检测或鉴定，或对同种菌属的分型鉴定。Dan He等人的研究中，利用多重PCR方法可同时对茄病镰刀菌、烟曲霉菌及光滑酵母菌三种真菌进行检测。与真菌培养相比，多重PCR技术可同时对样本中多种病原体进行检测，具有简单、快速、专一性强、稳定性高、可重复性强等优势[11,13]。

2.1.3实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)

实时荧光定量PCR是一种可以对PCR反应进程实时监测的技术[14]，其原理是在PCR反应体系内加入荧光报告基团，随着反应的进行、PCR扩增产物不断积累，荧光信号也相应逐渐增强，从而实现实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，可推断出模板最初的含量[15]。此前董铎等人报道了茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌及串珠镰刀菌的实时荧光PCR方法，敏感性高，检测的灵敏度可达1pg级,为临床真菌性角膜炎镰刀菌感染的诊断提供了一种快速准确的方法。相较于普通PCR技术而言，实时荧光定量PCR在反应体系中加入了荧光基团，通过对荧光信号进行检测，较电泳检测灵敏度高；其次，利引物和荧光基团同时与待测模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性；另外，通过对荧光信号的检测，可对反应进程实时监测、准确定量[16,17]，但该实验方法所需实验成本偏高。

2.1.4巢式PCR(nest-PCR)

巢式PCR，或称嵌套PCR，是一种利用两套PCR引物对，先后进行两轮PCR反应，从而扩增完整的目的基因片段的PCR手段。在第一轮反应中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增，得到小于第一次扩增产物的PCR产物片段[7]。而半巢式PCR与巢式PCR不同之处在于，在第二轮反应中，仅替换第一轮反应引物对中的一个，而保留另一个引物。在Parisa Badiee等人的研究中，纳入38例疑似真菌性角膜炎病例，结合角膜组织涂片检查、真菌培养、PCR及对抗真菌药的反应，其中28例诊断为真菌性角膜炎，巢式PCR检查结果与其匹配度(包括阳性率及阴性率)为81.6%，而KOH湿片法、革兰氏染色法及真菌培养的匹配度分别为76.3%，42.1%，68.4%。Haghani I等利用半巢式 PCR 对真菌性角膜炎进行诊断，阳性率可达 27.5%，而 KOH 湿涂片为10%，钙荧光白染色为25%，真菌培养为17.5%；敏感性分别为：KOH湿片法为28.5%，KOH湿片法联合钙荧光白染色为42%，半巢式PCR为57.1%；特异性分别为：KOH湿片法为94%，钙荧光白染色为78.7%，半巢式PCR为78.7%。可见，巢式PCR及半巢式PCR采用两个引物对、两轮PCR反应，提高了检测的灵敏度。但也因为两轮反应，中途需开盖处理，增加了污染的机会[18-20]。

2.1.5直接PCR(Direct PCR)

传统PCR方法均需经过DNA提取步骤，而DNA提取过程不仅耗费时间，而且还受到样本中致病病原体含量较低、提取过程中DNA模板丢失等条件的限制。而直接PCR通过将样本加无菌水混匀后，随后抽取部分含有样本的溶液直接用于PCR反应。无需提取DNA样本而直接进行PCR。直接PCR反应的关键因素为特殊的DNA聚合酶，即使样本背景复杂、病原体含量极低，也可获得良好的PCR结果。Zhao等人的研究显示，利用直接PCR方法对80份角膜刮片进行检测，其中66例结果阳性，总检测出率达82.5%。对34名高度怀疑真菌性角膜炎的患者，直接PCR的阳性率为84.8%。将重复的角膜刮片剔除后，阳性率增加到91.2%，显著高于培养基培养35.3%、涂片直接镜检64.7%， (P<0.001)，及共聚焦显微镜74.1%。直接PCR和真菌培养诊断感染性角膜炎的敏感性分别为98.0%和47.1%(P<0.001)，而特异性分别为81.8%和100%。另外，完成整个直接PCR过程仅需3 h[21]。直接PCR方法是一种新兴的诊断技术，省略了DNA提取步骤，大大缩短了检测所需时间，且感染性角膜炎具有高度敏感性和特异性，这种诊断方法对于及时制定有效的诊疗方案具有非常重要的意义。

2.1.6新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)

第一代DNA测序技术，包括传统的化学降解法、双脱氧链终止法及以其为基础的各种DNA测序技术，其中由于操作简便，Sanger法应用最为广泛。而新一代测序技术，又称为高通量DNA测序技术，相较于第一代DNA测序技术而言，可实现一次性对几十万到几百万条DNA分子序列测序。Zhi gang Li等人在一项回顾性研究中，利用新一代测序技术对16例感染性角膜炎患者及4个固定于福尔马林内的角膜样本进行分析，应用了Kraken及Centrifuge两种宏基因组学分类引擎分析基因序列，成功鉴定了大多数患者的真菌、细菌及阿米巴病原体[22]。在病原微生物的检测方面，通过NGS技术可以获得病原微生物的序列信息，甚至可以鉴定到种，与传统真菌检测方法相比较，大大缩短了鉴定所需的时间，为早期诊断及针对性用药提供了可能。但由于目前Genbank数据库对致病性病原菌基因序列收纳尚不完整，一些基因目前仍无法比对，另外该项技术所需实验条件及设备要求均较高，对于基层医院推广应用尚存在很大难度[22-24]。

2.2 DNA指纹技术(DNA Fingerprinting)

DNA指纹技术，即在分子水平上对DNA多态性进行研究，从而对致病性病原微生物分类鉴定的技术。目前用于真菌鉴定的DNA指纹技术包括限制性片断长度多态性分析(restricted fragment length polymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA分析(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片断长度多态性分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)或温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、单链构象多态性技术(single-strand conformation polymorphism,SSCP)等[7]。

2.2.1RFLP技术 RFLP技术是最早应用的DNA标记技术。对于不同来源的DNA，其特异限制性酶切位点分布不同，选择合适限制性内切酶酶切后，可得到长短不等的一系列片段，进行电泳、与标记的探针杂交放射自显影后，便可得到RFLP图谱。对酶切片段大小、数量以及构型差异进行分析，从而揭示DNA序列水平上的多态性。RFLP技术具有稳定性高、重复性好的特点，但操作过程复杂，耗费时间较长，且存在放射性危害[25]。

2.2.2RAPD技术 是一种以PCR为基础的分子标记技术。其原理为利用随机引物对DNA片段进行非定点PCR扩增[26]，随即进行凝胶电泳，可对扩增片段的多态性进行分析，进而得知DNA基因组相应区域的多态性。RAPD技术操作较简单，避免了RFLP技术中Southern杂交操作，且无需知晓DNA基因组序列信息，仅利用一套引物即可对不同菌种进行鉴定，但该技术对实验条件及设备的依赖性较大，重复性相对较差。

2.2.3AFLP技术 AFLP技术是RFLP技术及PCR技术相结合的分子标记技术，其原理是利用一种稀有位点的酶及一种多切酶对DNA基因组进行酶切，接着利用与两种限制性内切酶相对应的双链接头与DNA片段连接，最后应用与接头识别的引物对其进行扩增，最后利用聚丙烯凝胶电泳对得到的DNA片段进行分离，从而得出AFLP指纹图谱。利用AFLP技术可检测出亲缘关系较近的DNA样品中细微的差异，具有较高的稳定性及可靠性。同时避免了RFLP操作复杂、有放射性危害及RAPD稳定性差等缺点[27,28]。

2.2.4DGGE技术 是利用含有浓度线性递增变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将具有不同碱基序列但具有相似长度的双链DNA分离的分子标记技术[29]，对于长度相似或相同，而碱基组成的双链DNA片段而言，其所需解链温度不同，所需的变性剂浓度也不同。在由低到高浓度线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，随电泳进行，DNA双链片段在所需变性剂浓度位置处解链但不彻底分离，解链程度增大导致迁移阻力增大，当与电场力相平衡时，DNA分子不在电场中移动，由此形成图谱。借助DGGE技术，可将相同长度的双链DNA 片段分离，从而达到鉴别的目的。DGGE技术具有检测率较高，结果稳定等优点，但其并不能确定基因组中突变的位点，需借助其他分子学方法进一步分析[30]。

2.2.5SSCP技术 是利用单链DNA构象的多态性分析DNA单链碱基突变的一种分子标记技术。当靶基因片段中发生碱基突变(如碱基插入、改变、缺失等)时，DNA单链构象发生改变，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，长度相同但构象不同的DNA单链即呈现出构象多态性。该技术简单、灵敏、易于操作等特点，但仍需通过测序技术得知基因突变的位点及类别[31,32]。

2.3 核酸分子杂交技术

是一种基于碱基互补配对的原则，在一定条件下使靶基因变性、复性，并利用特异探针与靶基因核酸单链杂交为双链，从而对病原体进行检测的技术[33]。核酸分子杂交技术按反应条件又分为固相、液相杂交、原位杂交。固相杂交为将待测单链核酸结合到固相支持物上，随后放入含有标记探针的杂交液体中进行杂交，杂交双链便留在固相支持物上。原位杂交技术是以已知序列的特定标记核酸分子作为探针，与常规方法获取标本中病原体核酸进行杂交，无需提取DNA即可检测有无病原体感染的方法，但相较于其他分子诊断方法，其敏感性较低。与PCR技术相结合的反向斑点杂交技术，即PCR-RLB技术，则大大提高了检测的敏感性[34]。

2.4 基因芯片技术(Gene Chip)或称DNA微阵列技术(DNA microarray)

是在反向斑点杂交的基础上，将大量靶基因的探针有顺序的、高密度的排列固定在同一固相支持物上，称为基因芯片。可实现同时对大量待测片段进行检测，大大缩短了临床诊断所需时间。但基因芯片制作成本较高，且所需检测设备昂贵，使其应用局限于实验室内，未能广泛应用于临床病原微生物检测[11]。

2.5 质谱检测技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

近年来，质谱技术飞速发展，其中基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术是近年来新兴的一种软电离质谱技术，利用仪器软件绘制菌种的蛋白质谱峰图谱，并与已知病原菌标准蛋白质指纹图谱数据库比对，从而达到鉴定的目的[35]。 MADLI-TOF MS技术具有快速、灵敏、准确、高通量等特点，但由于目前已知微生物蛋白质指纹图谱数据库仍不完善，导致一些少见菌种的鉴定较为困难；对于样本处理办法的不同，并无同一的标准，导致实验结果的可重复性不高；若为同一菌属中较为相近的菌种，易导致鉴定错误。因此，我们需要继续完善数据库，规范样本预处理办法，同时与其它诊断方法相结合，以最大程度地发挥质谱技术的效用[36]。

2.6 环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)

是一种全新的核酸扩增技术，该技术在恒定温度下即可特异地将DNA片段扩增至109个拷贝，耗时多在1 h内。 其原理为对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而保证靶基因片段高效、快速、特异地扩增[37]。虽然引物设计与选择相对较复杂，但与常规PCR核酸扩增方法相比，LAMP四种引物需与位点完全匹配才能进行扩增，特异性较强；LAMP所需扩增模板为10拷贝或更低，灵敏度较高，但也因此非特异性扩增导致的假阳性率也随之升高；恒温扩增反应避免了PCR过程中变温耗时，确保反应可在较短时间内完成；另外，LAMP反应无需昂贵的PCR反应仪，降低了实验成本；此外，LAMP产物检测可通过直接观察或荧光检测等方法，步骤简洁。以上优势使LAMP拥有较广阔的应用前景[38,39]，但LAMP仅能对片段较小的短链DNA进行扩增，无法扩增较长的DNA片段，此外，由于该反应灵敏度较高，过程中易受污染物的影响而呈现假阳性的结果。

2.7 滚环扩增(Roiling Circle Amplification,RCA)

是一种近年来新兴的核酸扩增技术，其本质为以连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应为基础的一种恒温核酸扩增方法。其原理为以环状DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，使一个较短DNA引物沿模板链延伸、扩增，将dNTPs结合为包含大量重复的模板互补片段的单链DNA。这种方法可以通过简单、有效的过程实现对靶核酸的信号放大，不失为一种核酸检测的理想手段。除此以外，通过RCA技术，还可实现对包括RNA、SNP、蛋白质、病原体及病变细胞等目标进行检测[40,41]。具有高度特异性，操作简便及灵敏度较高的优点。但RCA技术也存在一定的制约，如锁式探针连接效率、背景信号干扰、拓扑结构的制约等等，仍需进一步解决[42]。

2.8 重组酶聚合酶扩增术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)

被称为可以替代PCR的核酸扩增技术。RPA作为另一种等温核酸扩增技术，通过模拟DNA体内扩增的过程，在37℃-42℃条件下，利用重组酶和单链结合蛋白协同实现引物和模板的特异性结合，从而实现核酸片段成指数扩增。作为一种新兴的恒温扩增技术，该技术具有快速、成本低、操作简单的特点，已逐渐应用于病原体检测领域，但仍存在一些不足，如其应用的探针及引物较特殊，使得RPA技术仅适用于长序列核酸分析等[43,44]。

上述分子诊断方法各有其优势，但大多需提前进行DNA模板提取。因此，实验室环境污染、操作不当则导致假阳性问题出现；此外，真菌性角膜炎组织样本内病原体量较少，若刮除方法不当、运输措施不当，经过DNA提取，则极易出现假阴性问题。实验所需仪器、设备以及有经验的操作人员，均给分子诊断方法在基层医疗机构的普及带来了障碍。因此，我们仍需作出更大的努力，使其朝着无需提取DNA模板、简化实验操作步骤及所需条件、检测结果的可视化等方向发展。

真菌性角膜炎是一种全球分布的致盲性眼病。就诊断方法而言，虽然直接镜检及培养的敏感性不高，但仍为诊断真菌性角膜炎的金标准，除此以外，例如共聚焦显微镜、各式各样的分子诊断学方法如PCR相关技术、新一代测序技术、DNA指纹技术、核酸分子杂交技术、基因芯片技术、质谱检测技术、LAMP、RCA、RPA等也为诊断提供了新的方向，节约了诊断时间，提高了检出率，有望使真菌性角膜炎得到早期诊断和及时治疗。