两种肿瘤干细胞球培养方法的比较

刘 芳，赵秀兰，孙保存,2，墨 晶，林 贤，董学易

随着肿瘤干细胞假说的提出，一些恶性肿瘤在放、化疗后远处复发转移及传统化疗药物无法根治的现象得到了很好地解释，同时为癌症的靶向治疗提供新的思路。因此，近几年来肿瘤干细胞的研究成为热点，富集肿瘤干细胞并保持其干性的培养方法是技术关键。Weiswald等[1]总结的4种体外三维培养模型中有2种适合肿瘤干细胞球培养：无血清神经干细胞培养基培养法、琼脂或琼脂糖表面含10%胎牛血清的完全培养基培养法。本实验着重探讨两种肿瘤干细胞球培养方法的优劣，为完善肿瘤干细胞球培养技术提供思路。

1 材料与方法

1.1材料黑色素瘤B16/F10，购自北京协和组织细胞库。RPMI1640培养基购自北京钮因泰克公司；干细胞诱导因子B27购自Invitrogen公司，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)购自 Pepro Tech 公司；抗体CD133购自Biorbyt公司。

1.2方法

1.2.1黑色素瘤干细胞球培养 (1)无血清神经干细胞培养基培养法：将正常培养处于对数生长期的B16/F10细胞制成单细胞悬液，以2×104个/孔的密度接种于超低吸附剂poly-hema包被的6孔板中，每孔2 mL培养液，培养基为DMEM/F12培养基，加入B27浓度为20 μL/mL，bFGF浓度为20 ng/mL，EGF浓度为20 ng/mL。在37 ℃ 5%CO2条件下培养，每隔3～4天换液，每隔7～8天传代；显微镜下观察细胞成球情况和形态。实验取第三代细胞球。(2)琼脂上含10%胎牛血清的完全培养基培养法：将正常培养处于对数生长期的B16/F10细胞制成单细胞悬液以2×104个/孔的密度接种于0.5%琼脂包被的6孔板中，每孔2 mL培养液，为含10%胎牛血清的完全培养液，在37 ℃5%CO2条件下培养，每隔3～4天换液，每隔7～8天传代；在显微镜下观察细胞成球情况和形态。实验取第三代细胞球。

1.2.2干细胞球蜡块、切片的制备 将干细胞球收集于离心管中，自然沉淀后弃上清，经10%中性福尔马林固定过夜，细胞球经脱水、透明、浸蜡、包埋等过程，最后制成石蜡块[2]，制成4 μm厚石蜡切片。

1.2.3免疫组化染色 免疫组化染色采用SP法，常规进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，抗原修复采用微波修复的方式，时间为10 min，山羊血清封闭后滴加一抗CD133，浓度为1 ∶100，4 ℃冰箱过夜，次日滴加山羊抗兔二抗、DAB显色。苏木精复染细胞核，脱水、透明、封固，显微镜下观察实验结果并拍照。组织中阳性细胞表达为棕黄色或黄褐色，每例标本选择含阳性细胞的10个高倍视野(×400)，计算阳性细胞在肿瘤细胞中所占百分率的均值。

2 结果

2.1细胞球形态差异从培养过程中观察发现无血清神经干细胞培养基培养法在培养过程中，尤其是第一代培养开始时，大量细胞死亡，少数细胞增殖成球，随着传代次数增加，死亡的细胞数大量减少，细胞球成球速度增快，数量增多，细胞球结构更加紧密。琼脂上完全培养基培养过程中，发生死亡的细胞数量较少，随着传代次数增加，变化并不明显，成球速度等方面变化也同样不明显。

从细胞球的形态上观察发现，无血清神经干细胞培养基培养法培养的细胞球比较规则，结构紧密的球体(图1A)；琼脂上完全培养基培养法培养的细胞球在形态上与之存在较大的差异，尤其是第一代细胞球的形成比较倾向于由细胞粘连而成，结构疏松，形态不规则，细胞球间粘连严重(图1B)。随着传代次数增加细胞球形态较为规则(图1C)，到第三代已无粘连现象。

2.2干细胞标志物表达差异CD133是相对分子质量为1.20×105的跨膜糖蛋白分子，其表达的特点是随着细胞的分化迅速下调，这使得它成为一个鉴定和分离干细胞的特异分子标志。因此我们在判断细胞球的干性时，将CD133强表达的细胞球判定为肿瘤干细胞球，而CD133弱表达的细胞球已经发生分化，判定为普通肿瘤细胞球。经计数显示，无血清神经干细胞培养基培养法培养的第三代细胞球CD133阳性率为92%，琼脂上含10%胎牛血清的完全培养基培养法培养的第三代细胞球CD133阳性率为65%，差异有显著性。提示在富集黑色素瘤细胞系B16/F10中的肿瘤干细胞过程中，无血清神经干细胞培养基培养法的效率要明显高于琼脂上完全培养基培养法(图2)。

①A①B①C②A②B图1 细胞球形态差异:A.无血清神经干细胞培养基培养法第三代细胞球;B.琼脂上含10%胎牛血清的完全培养基培养法第一代细胞球间存在黏附现象;C.琼脂上含10%胎牛血清的完全培养基培养法第三代细胞球 图2 细胞球CD133表达差异,SP法:A.肿瘤干细胞球中CD133呈强阳性;B.普通肿瘤细胞球中CD133呈弱阳性

3 讨论

本组从培养过程、细胞球形态、成球的速度等方面比较结果显示：无血清神经干细胞培养基培养法能快速稳定有效地培养出形态规则、结构紧密的细胞球，而琼脂上含10%胎牛血清完全培养基培养法效率较慢，细胞球形态变化大，可能是由于血清的存在影响细胞成球过程。

免疫组化结果显示，无血清神经干细胞培养基培养的第三代细胞球CD133阳性率为92%，琼脂上完全培养基培养的第三代细胞球CD133阳性率为65%。无血清神经干细胞培养基培养法与琼脂上含10%胎牛血清完全培养基培养法在黑色素瘤细胞系B16/F10干细胞的富集过程中差异比较有显著性。无血清神经干细胞培养基培养法能稳定快速有效的筛选出肿瘤干细胞，而琼脂上含10%胎牛血清完全培养基培养法培养的细胞球中较大比例细胞球是不具干性的细胞球，对肿瘤干细胞的富集效果差、效率低。

无血清神经干细胞培养基培养法是目前常用的干细胞体外培养方法，该培养法能富集肿瘤干细胞有以下原因：在低黏附性容器及无血清的条件下可以维持细胞未分化的状态[3]，非肿瘤干细胞之间缺乏周围细胞旁分泌及信号转导的支持，极易发生凋亡[4]，而培养液中加入大剂量的生长因子则可以促进细胞增殖，因此干细胞增殖，而非肿瘤干细胞增殖受到抑制，从而达到富集干细胞的目的。赵笛等[3]对无血清神经干细胞培养基培养法提出疑问，培养环境是人为制造的选择性培养肿瘤干细胞的环境：悬浮培养、无血清、高浓度的细胞生长因子，这些方面和体内微环境差异较大，以及部分分化的细胞在悬浮培养过程中会获得干细胞潜能，因此得到的干细胞不一定等同体内真正的干细胞，胡杨丽等[5]也有相似的观点。 赵笛等[3]还提到培养过程中细胞球的融合现象无法避免，会影响细胞球的克隆性。然而通过免疫组化染色发现每个细胞球中细胞CD133表达强度是一致的，细胞球之间的融合是否存在特定的信号传导，有待进一步分析。

琼脂上含10%胎牛血清培养基培养的方法中细胞虽然处于悬浮状态，缺乏周围细胞旁分泌及信号转导的支持，但由于血清的存在，细胞还是会分化，因此肿瘤干细胞的富集受到影响，实验结果也证实此方法富集肿瘤干细胞的效率明显地低于无血清神经干细胞培养基培养法。然而，与无血清神经干细胞培养基培养法相比，琼脂含10%胎牛血清培养基培养的方法培养环境能在一定程度上更接近体内微环境，这种培养方法培养的肿瘤干细胞是否更接近体内真正的干细胞？软琼脂上全血清培养基培养的方法在肿瘤干细胞培养方面是否还有改进的空间，这些有待进一步研究。

体内微环境复杂，随时都在变化，该环境无法完全模拟。肿瘤细胞的体外培养过程中，研究者只能让培养环境最大程度的接近体内环境，所以需要不断地探索和实验，使研究能更加接近事实真相，这值得科研人员进一步探索。

[1] Weiswald L B, Bellet D, Dangles-Marie V. Spherical cancer models in tumor biology[J]. Neoplasia, 2015,17(1):1-15.

[2] 董学易，赵秀兰，林 贤，等. 干细胞球石蜡蜡块的制备流程及注意事项[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(5):581-582.

[3] 赵 笛，郑 青. 悬浮培养在肿瘤干细胞研究中的应用及局限性[J]. 肿瘤, 2012,32(7):559-563.

[4] García-Gómez I, Elvira G, Zapata A G,etal. Mesenchymal stem cells:biological properties and clinical applications[J]. Expert Opin Biol Ther, 2010,10(10):1453-1468.

[5] 胡杨丽，杨举伦. 乳腺癌干细胞的生物学特性及治疗前景[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014,30(3):298-301.