精子自发顶体反应率与体外受精胚胎质量的相关性研究*

刘树沅，韦剑洪，陈伟辉，霍骏业

(广东省中山市博爱医院生殖中心 528403)

依据世界卫生组织(WHO)调查显示，已婚育龄夫妇的不孕症发生率约为10%，其中男性不育因素占总不孕患者的40%[1]，而在国内由于二孩政策开放和环境污染等因素，这一比例还有一定的升高[2]。为帮助不孕夫妇，辅助生殖技术(ART)得到了广泛应用，由于只有发生顶体反应的精子才能完成受精，检测精子是否已经发生顶体反应已成为评价精子质量和功能的重要指标，高于10%的自发顶体反应率则表现为病理性自发顶体反应升高，因此在男性不育的治疗中调整自发顶体反应率是治疗的重点目标[3]。在常规体外受精(IVF)中，密度梯度离心法和上游法常用于优化精子，是筛选不同顶体反应率精子简单、易行的方式。本文研究了精子自发顶体反应率以及两种精子处理方法与IVF胚胎质量的关系，探讨更合适的精液处理方法以及自发顶体反应率在临床指导授精方式方面的应用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2016年2月在本院生殖中心接受IVF治疗的不孕夫妇200对，男方年龄(33.9±5.1)岁，女方年龄(29.6±5.3)岁，每周期获卵数(11.5±3.2)个。将所有患者分为观察组和对照组，每组不孕夫妇100对，两组间男女年龄和周期获卵数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。排除标准：女年龄≥37岁，获卵数<5个者，男方严重少、弱精或无精子症者。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理 按照《WHO实验室手册》(第5版)采集和处理精液。不育男性患者需禁欲2～7 d，IVF当天通过手淫法取精，精液收集在无毒、无菌容器内，放置于温度为37 ℃的恒温板上，充分液化后混匀待用。

1.2.2对照组精子优化 采用密度梯度离心法处理。取40%和80% 精子梯度分离液(商品名:Sperm Grad)各1 mL，复温后在15 mL离心管内依次放入80%和40%精子梯度分离液各1 mL，注意保持液面分界清晰，在40%精子梯度分离液上方加入液化后的精液，300×g离心20 min，除去上清液，将沉淀移入3 mL G-IVF受精液中混匀，200×g离心5 min，去上清液，留约0.5 mL底层液体及沉淀，混匀后调整浓度备用。

1.2.3观察组精子优化 采用密度梯度离心法联合上游法处理。密度梯度离心法处理步骤同上，第2次离心处理后，弃上清液，将沉淀缓慢加入到含1 mL G-IVF受精液的小试管底部，倾斜放置，上游25～45 min，吸取云雾状的上层液体调整浓度后备用。

1.2.4授精方法和胚胎观察 取卵当天，患者注射绒毛膜促性腺激素(HCG)后38.5～40.0 h进行常规IVF授精，授精后17～19 h观察受精情况，计算受精率；授精后第3天观察胚胎发育情况，计算优胚率。

1.2.5精子自发顶体反应率检测 采用络合异硫氰酸荧光素的豌豆凝集素(FITC-PSA)荧光标记法顶体染色，使用安徽安科生物工程股份有限公司提供的试剂盒。取优化处理后的精子悬浮液5 μL涂片2张，自然干燥后以95%乙醇固定30 min。加入60～100 μL FITC-PSA工作液，4 ℃下反应2～17 h；用纯水冲片，1 000 倍油镜下观察，计数200个精子，计算自发顶体反应率。顶体完整精子判断标准为(1)顶体完整(AI)：精子头部有超过1/2荧光染色明亮且具有均匀性；(2)已发生顶体反应(AB)：精子仅在赤道带存在荧光带，或顶体区无荧光染色；(3)顶体异常：除上述两类精子之外的所有精子。

1.3观察指标 记录观察组自发顶体反应率，两组的受精率和优胚率。自发顶体反应率=顶体反应数/(顶体反应数+AI)×100%。顶体反应为已发生顶体反应精子，AI为顶体完整的精子。受精率=受精卵子数/获卵数×100%，优胚率=优质胚胎数/2PN受精卵数×100%，其中优质胚胎是指D3评分为7Ⅰ、7Ⅱ、8Ⅰ、8Ⅱ、9Ⅰ或9Ⅱ的胚胎。

1.4统计学处理 采用SPSS 19.0进行统计学分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；自发顶体反应率与受精率和优胚率的相关性用Spearman检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组间受精率比较及与自发顶体反应率相关性 对照组受精率为53.6%，观察组受精率为70.9%，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。观察组自发顶体反应率为16.9%，与受精率呈负相关(r=-0.890，P<0.05)，见图1。

图1 自发顶体反应率与受精率相关性

2.2两组间优胚率比较及与自发顶体反应率相关性 对照组优胚率为43.6%，观察组优胚率为55.9%，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。观察组自发顶体反应率为16.9%，与优胚率呈负相关(r=-0.647，P<0.05)，见图2。

图2 自发顶体反应率与优胚率相关性

3 讨 论

IVF是帮助不孕不育夫妇妊娠的重要治疗手段，在IVF治疗过程中，最为重要的就是提高受精率和优胚率，以达到改善不孕不育患者妊娠结局的目标[4]。精液处理技术是男性不育治疗的重要手段，其中上游法和密度梯度离心法是目前精子优化处理的常用技术。上游法是利用精子自身的活动能力上游到培养液上层而进行优化，密度梯度离心法则根据精子密度利用离心力筛选精子，二者都能提高活动精子的百分率，上游法回收率较低。本文研究显示，观察组的受精率和优胚率均明显高于对照组(P<0.05)，密度梯度离心法联合上游法能够选出质量更好的精子，有利于提高胚胎质量。

顶体反应是精子在受精过程中所经历的重要环节之一，在受精过程中精子必须完成顶体反应，释放顶体细胞溶解酶，使得精子在穿透透明带过程中产生一条轨道，协助精子穿过透明带与卵子结合[5]，如果精子在与透明带结合之前便发生自发顶体反应，则会失去受精能力，因此检测精子是否发生顶体反应已成为评价精子质量和功能的重要手段。目前，大多数顶体反应试验方法是使用各类的诱导剂或激动剂，如人卵泡液、孕酮或钙离子载体等[6]。这些试验都具有费用高、不稳定等特点，临床应用受限。本研究采用FITC-PSA荧光标记法顶体染色对精子顶体功能进行检测，能够实现对精子顶体完整性进行科学评估，同时该种检测方法能够解决常规形态学方法不能有效判别精子自发顶体反应的问题，检测结果更具客观性和科学性[7]。

通过人工诱导发生顶体反应在临床上有大量研究。LIU等[8]在对钙离子载体A23187诱导的顶体反应精子形态及体外受精率进行的两次研究就出现过结果不一致现象；而LIU等[9]采用人卵泡液对精子顶体反应进行诱导，观察到顶体反应率与体外受精率存在明显相关性，但是李建平等[10]的研究结果却与之相悖。这提示在使用人工诱导顶体反应的尝试中仍存在稳定性差、成本高等难题。本文研究结果显示，自发顶体反应率与受精率呈负相关(r=-0.890，P<0.05)，与优胚率呈负相关(r=-0.647，P<0.05)，提示降低精子自发顶体反应率可以提高受精率和优胚率，有助于改善IVF的成功率和妊娠结局。另外，对于常规精液分析正常，而IVF不明原因反复受精失败的患者，可能存在顶体反应缺陷，可以通过检测精子自发顶体反应率考虑优先采用何种授精方式。对于自发顶体反应率明显升高的患者，可考虑选择卵子胞质内单精子注射的辅助生殖技术，而用于选择授精方式的自发顶体反应率参考阈值，则需要扩大样本量进一步研究和探讨。

综上所述，密度梯度离心联合上游法可以获得更好的受精率和优胚率，自发顶体反应率与组间IVF受精率呈负相关，随自发顶体反应率的增加，受精率呈降低的趋势；自发顶体反应率与组间IVF优胚率呈负相关，随自发顶体反应率的增加，优胚率呈降低的趋势。自发顶体反应率可以为不孕不育患者临床治疗方式的选择提供指导。

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[10]李建平,钟影,吴东,等.人卵泡液诱导的顶体反应,精子形态与体外受精率的关系[J].中华男科学杂志,2006,12(7):605-607.