nuocytes相关因子在规律血液透析治疗2型糖尿病肾病患者中的免疫学意义*

路 萍，徐芸芸，许化溪，苏兆亮

(1.江苏大学附属人民医院，江苏镇江 212001；2.江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学与免疫检验学系，江苏镇江 212013)

糖尿病肾病患者体内存在非常复杂的代谢紊乱，即使配合规律血液透析治疗，该疾病仍是终末期肾脏病中治疗最棘手、预后最差的类型之一，深入探索其发病机制意义重大。近年来，科学家们发现一类“跨界细胞”，是天然免疫细胞中的一部分，却表现出适应性免疫细胞才具有的功能，存在于这两种免疫反应的空窗期，虽然不会独立导致疾病，却起到放大免疫反应，加重机体损伤程度的作用，nuocytes就是其中之一。以往对nuocytes相关因子的研究多集中在支气管哮喘、炎症性及过敏性疾病[1-3]。近几年也发现该类细胞的极化状态参与了病毒性肝炎、胃癌、甲状腺功能亢进等疾病的发生、发展[4-6]。相关研究表明糖尿病肾病是一种炎症状态，免疫细胞可能参与了糖尿病肾病的发展及恶化进程[7]。Nuocytes的这一跨界特性是否参与了糖尿病肾病的发展及并发症的出现和进展过程，国内外少见相关报道。

本课题对在江苏大学附属人民医院人工肾规律血液透析治疗的糖尿病肾病患者进行研究，所有入选患者随访6个月，对随访阶段所有患者出现的并发症情况进行监测，并进一步统计分析，以期更全面地评估nuocytes相关因子与糖尿病肾病的关系，为从上游领域进行临床预防、干预及治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年11月至2015年1月在江苏大学附属人民医院人工肾规律血液透析治疗超过3个月的稳定2型糖尿病肾病患者30例(K0组)，其中男25例、女5例，平均年龄(54.20±6.63)岁。排除风湿、结缔组织疾病、移植肾肾脏疾病、囊肿性肾脏疾病(多囊肾)、肿瘤及慢性消耗性疾病患者；伴有严重的原发性心血管疾病、肝脏疾病、肺脏疾病，或影响生存的其他严重疾病及不愿参加此研究者予排除。另选取同期与K0组性别、年龄相仿的门诊健康体检人员30例作为健康对照(N0组)，其中男23例、女7例，平均年龄(51.17±6.42)岁。本研究经医院伦理委员会审议通过，所有受试对象自愿参加本研究并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1透析方法 所有患者每周透析2～3次,均使用聚砜膜透析器，血流速度200～250 mL/min，透析液流速500 mL/min。

1.2.2随访 患者入选后随访6个月，对随访阶段患者新出现的感染性并发症情况进行记录。

1.2.3外周血单个核细胞分离 所有入选者清晨空腹抽血化验，取外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，收集血浆，人淋巴细胞分离液(天津灏洋公司)密度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，加入1 mL Trizol(Invitrogen公司)裂解细胞，-70 ℃冰箱冻存待提取RNA。

1.2.4总RNA提取、引物设计及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR) 异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA，反转录合成cDNA,以cDNA为模板，应用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa公司)进行PCR反应，总反应体系20 μL，严格按照试剂盒说明书操作。分别对nuocytes相关的转录因子视黄酸受体相关孤核受体α(RORα)、白细胞介素-17受体B(IL-17RB)、IL-33受体T1/ST2、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)的mRNA表达水平，以及Th1/Th2特征性细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)，转录因子T-bet和GATA-3 mRNA 表达水平进行检测。引物序列参照文献设计，由上海生工检测合格后合成。RORα上游引物为5′-CTG ACG AGG ACA GGA GTA GG -3′，下游引物为5′-GTG CGC AGA CAG AGC TATT C-3′，产物大小为204 bp；IL-17RB上游引物为5′-CTT GGT GGC CTT CAA CAA GC-3′，下游引物为5′-AGA GCC GAC CGT TCA ATG TG-3′，产物大小为200 bp；T1/ST2上游引物为5′-AGA TGA GTC ACT GGC ATA CG-3′,产物大小为216 bp;IL-5上游引物为5′-ACT CTC CAG TGT GCC TAT TC-3′，下游引物为5′-CTG CTG ATA GCC AAT GAG AC-3′，产物大小为101 bp； IL-13上游引物为5′-GGC TGA GGT CTA AGC TAA GG-3′，下游引物为5′-GAC AGC TGG CAT GTA CTG TG-3′，产物大小368 bp；IFN-γ上游引物5′-GCA GAG CCA AAT TGT CTC CT-3′，下游引物为5′-ATG CTC TTC GAC CTC GAA AC-3′，产物大小为290 bp；IL-4上游引物为5′-CTG CAA ATC GAC ACC TAT TA-3′，下游引物为5′-GAT CGT CTT TAG CCT TTC-3′，产物大小为449 bp；T-bet上游引物为5′-AAT GCA GGC TTC ATG CTG AC-3′，下游引物为5′-GCC TAC CAG AAT GCC GAG AT-3′，产物大小为314 bp ；GATA3上游引物为5′-TTG TGG TGG TCT GAC AGT TC-3′，下游引物为5′-AGT ACA GCT CCG GAC TCT TC-3′，产物大小为341 bp ；β-actin上游引物为5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′，下游引物为5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′，产物大小为262 bp。以目的基因mRNA 的表达水平与内参基因β-actin mRNA 的表达水平相对变化作为判断指标并统计分析。目的基因表达水平通过β-actin进行校准。

2 结 果

2.1规律血液透析治疗的糖尿病肾病患者在随访阶段并发症发生情况 K0组30例患者中9例出现呼吸道感染性疾病并住院，均为男性，设为K1组，未出现其他感染性疾病；其他未出现呼吸道感染性疾病的21例设为K2组。因K1组均为男性患者，平均年龄(54.56±7.21)岁，故在N0组30例中选取6例与其年龄、性别相匹配的健康体检者作为N1组进行比较,平均年龄(52.33±4.50)岁。

2.2K0组与N0组研究对象PMBC中nuocytes及Th1/Th2相关因子mRNA表达水平比较 K0组nuocytes相关因子IL-5 mRNA表达水平较N0组有升高，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；nuocytes转录因子RORα,膜受体IL-17RB，T1/ST2及细胞因子IL-13 mRNA表达水平与N0组相比，有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；Th1/Th2相关因子比较，K0组GATA-3、INF-γ、IL-4 mRNA表达水平与N0组比较有升高趋势，T-bet mRNA水平有下降趋势，但差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3K1组及K2组患者nuocytes及Th1/Th2相关因子mRNA表达水平比较 与K2组患者比较，K1组患者nuocytes转录因子RORα，膜受体IL-17RB,细胞因子IL-13 mRNA及Th2细胞转录因子GATA-3 mRNA表达水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4K1组与N1组研究对象PBMC中nuocytes相关因子mRNA表达水平比较 K1组患者入选时PBMC的nuocytes相关转录因子RORα，2种膜受体IL-17RB、T1/ST2，细胞因子IL-5 mRNA表达水平较N1组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；K1组INF-γ、GATA-3 mRNA 表达水平与N1组比较有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；K1组IL-4 mRNA水平较N1组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；K1组T-bet mRNA水平较N1组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 K0组与N0组研究对象PMBC中nuocytes及Th1/Th2相关因子mRNA表达水平比较结果

表2 K1组及K2组患者nuocytes及Th1/Th2相关因子mRNA表达水平比较

表3 K1组及N1组研究对象nuocytes及Th1/Th2相关因子mRNA表达水平比较

2.5K1组患者入选时检测的PBMC中nuocytes相关因子IL-17RB、IL-5、IL-13 mRNA与RORα mRNA表达水平相关性分析 因呼吸道感染性疾病住院的糖尿病肾病男性患者nuocytes受体IL-17RB(r=0.824,P=0.006,图1A)及细胞因子IL-13(r=0.822,P=0.007，图1B)、IL-5(r=0.668,P=0.049，图1C)与转录因子RORαmRNA 表达水平呈正相关。

2.6K1组患者入选时检测的PBMC中Th1/Th2相关因子mRNA表达水平与nuocytes相关因子mRNA表达水平的相关性分析 结果显示除GATA-3与RORα mRNA表达水平正相关(r=0.708,P=0.033)外，暂未发现其他因子有明显相关性。见图2。

图1 K1组患者入选时PBMC中L-17RB、T1/ST2、IL-5、IL-13与RORαmRNA表达水平相关性分析

图2 K1组患者GATA-3、RORα mRNA表达水平相关性分析

3 讨 论

nuocytes在2010年由NEILL等[8]首先报道，是外周血中的Ⅱ型固有免疫细胞，被认为是激活Th2 型免疫反应的第一个细胞。nuocytes细胞来源于淋巴细胞，分化成熟取决于转录因子RORα以及Notch信号转导途径[9],IL-25和IL-33被定义为Th2型免疫反应所必需，存在于nuocytes细胞表面的IL-17RB、T1/ST2是针对IL-25和IL-33的天然受体，可接受此两种细胞刺激，诱生和分泌IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，促进Th2细胞适应性免疫应答[10-11]。

2型糖尿病、终末期肾衰竭、血液透析患者体内均存在微炎症状态[12-14]；规律血液透析的糖尿病肾病患者可谓是上述几类疾病极端化表现的个体，对该类人群的研究更容易发现nuocytes相关因子蕴藏在这类人群中的免疫学意义。

本研究显示：与N0组比较，K0组患者中仅IL-5 mRNA表达水平升高差异有统计学意义(P<0.05)；但K1组与N1组比较，nuocytes转录因子RORα、膜受体IL-17RB与T1/ST2以及细胞因子IL-5的mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，进一步对该组患者的Pearson相关性分析发现，nuocytes膜受体 IL-17RB及细胞因子IL-13、IL-5与转录因子RORα的mRNA表达水平正相关。

IL-5 主要来源于活化的Th2细胞，IL-5在黏膜免疫，维持嗜酸性粒细胞的成熟和生存、促进嗜酸性粒细胞向肺部炎症区域迁移中意义重大，引起局部或全身性的过敏性炎性反应[15]。由此推断规律透析的糖尿病肾病患者体内存在类似于支气管哮喘及过敏性疾病的慢性致敏状态，致敏的程度决定以后出现感染性疾病发生的风险。

IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞的特征性细胞因子，其转录因子分别为T-bet和GATA-3，对Th1和Th2细胞特征性细胞因子及转录因子表达水平的研究可以反映Th1/Th2的平衡状态。本研究并未发现K0组患者与N0组Th1/Th2细胞相关因子表达水平有差异，但K1组患者与N1组比较IL-4 mRNA表达水平升高(P<0.05)，T-bet mRNA表达水平降低(P<0.05)。与nuocytes相关因子Pearson相关性分析提示GATA-3 mRNA与RORα mRNA表达水平呈正相关(r=0.708,P=0.033)。上述结果提示因呼吸道感染性疾病住院的糖尿病肾病血液透析男性患者在感染发生的数月前体内即存在Th1/Th2的失衡，表现为Th2细胞优势化，nuocytes相关因子的极化状态参与了这一过程。

对糖尿病肾病的研究任重而道远，其中涉及免疫学机制的研究因可从上游领域干预疾病的发生、发展及并发症的形成，意义尤为重大。本文涉及的患者是一类极端化表现的个体，且样本量有限，应进一步扩大样本量，并在患者并发症出现时及治疗后重复初始试验，将更有利于全面地评估nuocytes相关因子在该类患者中的免疫学意义，也将为糖尿病肾病的临床治疗、并发症的预测及早期干预提供理论依据。

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