冷冻前预处理对新西兰兔精液超低温保存品质的影响

徐婷婷 刘运镇 纪康 赵莎莎

摘要：以新西兰兔精液为研究对象，对新鲜精液采用不同的静置时间、离心速度、离心时间及精清留量进行处理，经过超低温保存后，通过测定精子活率、顶体完整性、质膜完整性来选择兔精液冷冻保存最近佳预处理方案。结果表明，精液离心前静置60～90 min再以 1 000 r/min的速度离心，其冻后活率及复苏率明显优于其他静置时间；离心 10 min 时的效果优于其他离心时间；采用1 000 r/min的速度离心时，相同离心时间均较其他离心速率冷冻-解冻后精液活率、复苏率、精子质膜完整性和顶体完整性高；离心后，精清留量和精液的体积比为1 ∶[G-3]1的冻后活率、复苏率、精子质膜完整性和顶体完整性优于精液与精清的体积比为0 ∶[G-3]1、2 ∶[G-3]1。

关键词：兔；精液保存；活率；顶体；完整性；质膜；精清留量

中图分类号：S82913+4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0243-02

精液超低温冷冻保存，对动物种质资源保护有重要作用。精液冷冻保存在牛、猪上都有比较成熟的技术方案，在生产实践上应用较广泛。但迄今为止，关于兔精液的冷冻保存研究相对较少，尚未形成完整的技术方案和技术突破。由于夏季气温较高，兔的受孕率不论是自然受孕还是人工授精都比春秋季大幅降低，给养兔业带来了较大的影响，因此研究兔精液超低温保存、形成完整的技术准则成为当前最迫切的研究任务。

1材料与方法

11材料

111仪器设备

电子天平、荧光倒置显微镜、电热恒温水浴锅、电热恒温干燥箱、CO2培养箱、离心机、液氮生物容器、冰箱、蒸汽灭菌器、双人单面净化工作台、超声波清洗仪、加热板、025 mL细管等。

112试剂

NaCl、Cl、Na2HPO4·12H2O、H2PO4、CaCl2、MgCl2、无水葡萄糖、二水柠檬酸钠、青霉素钾、硫酸链霉素、柠檬酸、甘氨酸、甘油、牛血清白蛋白、Tris。

113试验动物

江苏盐城正山兔业有限公司的1～2岁优质新西兰种公兔，体质健康，无繁殖疾病。试验兔单笼饲养，饲养温度24 ℃左右，湿度50%左右，每天光照12 h，定量喂食全价配合饲料，自由饮水。

12方法

121溶液的配制

PBS液（磷酸盐缓冲液的配制： NaCl 08 g，Cl 002 g，CaCl2 0013 2 g，Na2HPO4·12H2O 0289 8 g，H2PO4 002 g，MgCl2·6H2O 0012 1 g，加双蒸水至100 mL，pH值调至72，022 μm滤膜过滤，4℃保存备用。

BTS液（常温保存液的配制：葡萄搪37 g，二水柠檬酸三钠06 g，乙二胺四乙酸二钠0125 g，NaHCO3 0125 g，Cl 0007 5 g，青霉素钠006 g，硫酸链霉素01 g，加双蒸水至100 mL，pH值调至72，022 μm滤膜过滤，4℃保存备用。

冷冻稀释液的配制：葡萄糖159 g，柠檬酸196 g，Tirs 352 g，青霉素钠006 g，硫酸链霉素01 g，甘油4%，卵黄20%，加双蒸水至100 mL，pH值调至621，022 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。

解冻液的配制：葡萄糖50 g，柠檬酸钠05 g，10%安钠咖5 mL，青霉素8万IU，硫酸链霉素10万IU，加双蒸水至100 mL，022 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。

PI染色溶液的配制： PI 005 g溶解于20 mL PBS液中，4℃保存备用。

DABCO防荧光淬灭剂的配制：甘油/PBS（9 ∶[G-3]110 mL、DABCO 0024 6 g，1 mL分装，4 ℃保存备用。

122精液采集

在采精器中注入温水并装上预热至35～37 ℃的集精管，将发情成年母兔放入公兔笼内，诱导公兔爬跨母兔，将阴茎导入母兔阴门处的采精器内，公兔射精后侧倒时迅速将采精器竖立拿出兔笼，弃去夹层中的温水，使精液全部流入集精管中。于 37 ℃下进行精液常规质量检查，选择无异味、乳白色、精子形态正常、活率在07以上、密度适中的精液用于试验。精子活率的检测方法：20 μL精液充入37 ℃预热的血细胞计数板上，显微镜下观察向前运动精子所占的比值即为精子活率。

123精液的预处理

1231离心前静置时间将采集的合格精液保存在37℃的保温瓶中，分别静置15、30、60、90 min。

1232离心速率分别以500、1 000、1 500、2 000 r/min的速度分别离心5、10、15 min。

1233精清留存量将离心后的精液分别按照精清与精子的体积比为0 ∶[G-3]1、1 ∶[G-3]1和1 ∶[G-3]2的量留取，然后用等温稀释液进行稀释。

1234稀释与平衡将符合要求并且经过预处理的精液按1 ∶[G-3]2的体积比与等温的稀释液混合，摇匀，放入5 ℃冰箱中平衡2 h。

1235冷冻精液的制备与解冻采用025 mL细管法进行冷冻，将装有精液的细管置于充分预冷广口冷冻容器内的管架上，距离液氮面3 cm，熏蒸10 min，然后投入液氮罐提桶内保存。解冻时，将细管取出后直接投入37 ℃温水中解冻45 s，用等温解冻液按体积比为1 ∶[G-3]10稀释，37℃水浴10 min。

1236精液品质检测指标及方法（1精子活率。取 10 μL 精液PI荧光染色法进行判断（死精子PI染色后呈阳性，活精子PI染色后呈阴性，置于载玻片上，盖上盖玻片，在 400×显微镜下评定精子活率。每次至少检查 200 个精子。计算公式：活率=未着色精子数/总精子数。（2质膜完整率。将解冻后的精液用果糖-柠檬酸钠低渗液（0675 6 g 果糖、0367 6 g二水柠檬酸钠溶于50 mL双蒸水中稀释，调整精子密度为 100万～200万spz/mL，37 ℃孵育 30 min，取 20 μL 精子悬液于血细胞计数板上，400×倒置显微镜观察，每次至少计数 200 个精子，计算弯尾精子的比率，计算公式：质膜完整率=弯尾精子数/总精子数×100%。（3精子顶体完整率。采用姬姆萨染色法测定，计算公式：精子顶体完整率=顶体完整精子数/总精子数×100%。

13数据统计

所有处理均至少重复5次，每次计数精子数不少于200个。采用t检验和方差分析法对试验数据进行统计分析，P<005为差异显著。

2结果与分析

3结论与讨论

试验结果表明，在稀释前将精液静置60～90 min可有效地使精子和精清接触，精子获得了对冷休克及冷冻损伤更强的抵抗力，静置时间太长可引起精清变质，从而对精子质量产生影响。同时，精子不运动也容易形成假死状态，静置时间过短，精子不能和精清充分接触，对冷休克和冷损失的抵抗能力较差。

以1 000 r/min的离心速度离心10 min，解冻后活率、复苏率、质膜完整率和顶体完整率分别达到038、5429%、5326%、7438%。不离心或者离心速率太小、时间太短，精液体积过大稀释效果不佳，而如果离心速度过快、时间过长则会使精子在离心管底部凝结，从而导致形态异常，活率下降。endprint