中药制剂兰州方对免疫介导的再生障碍性贫血模型小鼠骨髓增殖的影响

黄邦荣，张永萍，倪 红，李治梅

（1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.武威肿瘤医院，甘肃 武威 733000）

再生障碍性贫血（简称再障）属中医学“血虚”“血证”“虚劳”“虚损”及“血枯”等范畴，中医认为肾主骨，骨藏髓，髓血同源，可见肾与骨髓造血有密切关系。中医还认为“血者水谷之精也，生化于脾”“中焦受气取汁，变化而赤是为血”，可见脾与造血也有一定关系。因此，辨证论治应以肾、脾为核心，尤其以肾为主。全国著名中西医结合专家裴正学教授认为：健脾补肾是治疗再障的根本大法，在此理论基础上，根据多年临床经验，研制出具有补肾生髓、健脾益气、养血和胃功效的兰州方，对治疗再障、调整机体免疫功能具有良好疗效。为进一步研究中医健脾补肾理论治疗再障的作用机理，进行中药制剂兰州方对再障模型小鼠骨髓增殖的实验研究，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，体重（20±2）g，8～10周龄；DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周龄[1]。由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第14-009号。

1.1.2 药品 兰州方（由生地、山萸肉、山药、丹皮、北沙参、人参须、潞党参、太子参、桂枝、浮小麦、大枣、麦冬、五味子、炙甘草、白芍、墓头回等组成，由甘肃省兰州市荟萃堂制成颗粒冲剂，每包含生药量36.25 g），贞芪扶正颗粒（由佛慈制药有限公司提供，国药准字262020416）。

1.1.3 仪器 直线加速器（德国，西门子Primus）、光学显微镜（Olympus，Bx60-F5）、超净工作台（苏净集团，苏州安泰空气技术有限责任公司 VS-1300L型）、脱水机（德国，LEICATP1020）、切片机（德国，LEICARM2135）、病理组织漂烘处理仪（常州中威电子仪器厂，PHY-Ⅲ型）、包埋机（常州中威电子仪器厂，BMJ-Ⅲ型）、染色仪（常州中威电子仪器厂，CM1900HE）。

1.1.4 胸腺、淋巴结细胞悬液制备 取DBA/2小鼠断颈处死，用75%酒精浸泡5分钟，常规消毒后，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻剪碎、碾碎后，用200目尼龙网过滤，通过4号针头制作成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达95%以上。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 参照姚军等再障造模，并根据赵忻等[2]关于免疫介导小鼠再障造模的方法进行改进，除正常对照组的15只BALB/C小鼠外，将其余75只BALB/C小鼠（剩余组）经直线加速器6 Mvγ射线照射全身，照射高度100 cm，时间1分钟，剂量3.0 GY。照射4小时内，经尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结细胞悬液0.2 ml，细胞数1×106/只[3]。造模一周后，经尾静脉采血，血分析结果表明：剩余组的白细胞、血小板、血红蛋白与正常对照组比较，均明显下降（P＜0.01或P＜0.05），见表1。骨髓涂片：造模一周后，每组随机取5只小鼠，脱颈处死后取出左侧股骨，用4号针头取1 ml RPMI-1640液冲出骨髓滴于载玻片上推片，进行HE染色，在光学显微镜下进行骨髓组织形态学观察[4]。结果表明，剩余组小鼠骨髓涂片显示骨髓增生低下，粒系平均＜15%、红系＜7%、巨核细胞0～7个/HP；正常对照组骨髓增生活跃，粒系平均＞40%、红系平均＞14%、巨核细胞45～72个/HP，两组比较，有显著性差异（P＜0.05）。以上结果证实本实验所复制的免疫介导的再障小鼠模型是成功的[5]，可以按原方案进行后期实验。

表1 直线加速器γ射线对再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影响（±s）

表1 直线加速器γ射线对再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

PLT（×109·L-1）1 588.4±240.00 655.3±125.96**组别正常对照组（n=15）剩余组（n=75）HGB（g·L-1）134±16.00 112±9.39*RBC（×1012·L-1）8.91±1.20 8.08±0.58 WBC（×109·L-1）9.12±3.36 4.20±0.96**

1.2.2 动物分组 将BALB/C小鼠90只随机分组，其中正常对照组15只，兰州方大、中、小剂量组各15只，模型组15只，贞芪扶正颗粒对照组15只。

1.2.3 给药方法 模型组给予等量生理盐水灌胃，兰州方（颗粒）、贞芪扶正颗粒使用前分别用蒸馏水充分溶解，根据文献中人/小鼠用药等效剂量换算法，中药的中剂量组相当于成人临床用量的20倍[6]，故兰州方大、中、小剂量组分别给予0.02 g/g·d、0.01 g/g·d和0.005 g/g·d药液1 ml（相当于成人用量的40倍、20倍、10倍）；给予贞芪扶正颗粒每只0.01 g/g·d（相当于成人临床用量的20倍）1 ml。各组均以普通饲料喂养，连续灌胃40天[7]。

1.2.4 小鼠骨髓有核细胞计数 骨髓有核细胞（BMC）提取：参照唐佩弦等[8]的方法，灌胃40天后，先用颈椎脱臼法处死小鼠，然后用鼠齿镊夹住左侧股骨（右侧待用），剪去骨骺，用20号针头刺穿骨末端，接着用注射器吸取RPMI-1640培养液2 ml向骨髓腔内快速推入，冲洗出骨髓细胞，收集在灭菌离心管内，最后用注射器反复推拉骨髓细胞悬液几次，使骨髓细胞充分分散，制成悬液，以备光学显微镜下进行有核细胞计数。

将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上，将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3分钟，镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下列公式计算：细胞数/ml=四大格细胞总数/4×10 000。

1.2.5 骨髓组织形态学观察 取小鼠右侧股骨中段，经甲醛固定、脱钙、石蜡包埋、切片、HE-Giemsa染色等处理后备用。将切片放在光学显微镜的高倍镜下（10×40）观察，按文献[4]方法，用5×5规格的网形测微器以计点法测定骨髓造血组织容量百分率，即时随机选择10个视野，观察与记录每个视野内10个点所击中的目标，如果交接点击中造血组织或脂肪组织或血窦，即记录为1点；如击中造血/脂肪组织的边界，即记录为1/2点，共观察100点，按下列公式计算出造血组织、脂肪组织和血窦的容量百分率。造血组织容量百分率（%）=造血组织击中数/（造血组织击中数+脂肪组织击中数+血窦击中数）×100%。脂肪组织容量百分率（%）=脂肪组织击中数/（造血组织击中数+脂肪组织击中数+血窦击中数）×100%。

1.2.6 统计学方法 应用统计学软件SPSS 10.0进行数据统计，所有实验数据均以±s）表示。两组计量资料采用Student's ttest检验，多组间计量资料采用单因素方差分析（One-way anovo），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 股骨BMC计数（见表2）

表2 股骨BMC计数（±s）

表2 股骨BMC计数（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

分组正常对照组模型组兰州方大剂量组兰州方中剂量组兰州方小剂量组贞芪扶正颗粒对照组有核细胞计数（×106/L）12.22±0.66 2.72±0.52*4.14±0.99**#6.34±0.14*##4.39±0.61**#4.32±0.32**##

由表2可见，模型组，兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒对照组小鼠BMC计数较正常对照组小鼠明显减少（P＜0.05或P＜0.01）；兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒对照组BMC计数较模型组显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；兰州方大、中、小剂量组BMC的计数与贞芪扶正颗粒对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 骨髓组织形态学观察（见表3）

表3 骨髓组织形态学观察（±s）

表3 骨髓组织形态学观察（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与兰州方中剂量组比较，△P＜0.05

分组正常对照组模型组兰州方大剂量组兰州方中剂量组兰州方小剂量组贞芪扶正颗粒对照组造血组织容量百分率（%）92.22±0.66 10.72±2.52*26.57±2.24*#△36.38±2.34*#29.10±1.06*#△27.22±1.46**#△脂肪组织容量百分率（%）1.72±0.23 21.08±2.21*26.19±2.61**##△22.34±1.14**#24.14±0.99**##△28.32±0.35*#△

由表3可见，模型组，兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒对照组造血组织容量百分率较正常对照组明显减少（P＜0.05或P＜0.01）；模型组，兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒对照组脂肪组织容量百分率较正常对照组明显增多（P＜0.05或P＜0.01）；兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒对照组造血组织容量百分率较模型组显著升高（P＜0.05），而脂肪组织容量百分率较模型组亦显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；兰州方大、小剂量组造血组织容量百分率和脂肪组织容量百分率与贞芪扶正颗粒对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）；兰州方中剂量组造血组织容量百分率高于兰州方大、小剂量组和贞芪扶正颗粒对照组（P＜0.05）；兰州方中剂量组脂肪组织容量百分率低于兰州方大、小剂量组和贞芪扶正颗粒对照组（P＜0.05）。

3 讨论

（1）骨髓造血是造血祖/干细胞通过有丝分裂分化增殖的动态过程，各级祖细胞经过不断增殖分化，形成各种原始幼稚细胞，最后发育为成熟血细胞而释放入周围血。骨髓中的有核细胞由上述各级细胞组成，其数量变化在一定程度上代表了骨髓造血细胞增殖的程度。骨髓造血组织主要由网状结缔组织和造血细胞组成。网状细胞和网状纤维构成造血组织的网架，网孔中充满不同发育阶段的各种血细胞以及少量造血干细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和间充质细胞等，造血组织含量的提高是骨髓造血细胞增殖量化的反映。

（2）本次结果表明，兰州方中健脾补肾、益气活血的中药的确可以促进骨髓造血细胞增生，提高造血组织容量百分率，使用药后兰州方大、中、小剂量组造血组织容量百分率和脂肪组织容量百分率趋于1∶1的正常姿态，从而提高外周血象相关指标。大量临床与实验研究报道也证明[9-10]，健脾补肾活血的方药能提高免疫介导再障小鼠骨髓CFU-GM、CFU-S、BFU-E、CFU-D、CFU-E产率，改善骨髓环境，从而调节和促进造血细胞的增殖分化，使造血组织容量百分率增加。除此之外，兰州方能改善骨髓微环境，有利于骨髓基质细胞及其细胞外基质生长，增强基质细胞黏附造血细胞的能力，以此调节和促进造血细胞的增殖分化，使造血组织容量增加、外周血细胞回升。

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