添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响及保护机理

何小勇，任大军，邓志群，刘海，张淑琴，张晓晴

(武汉科技大学 资源与环境工程学院，湖北 武汉，430080)

添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响及保护机理

何小勇，任大军*，邓志群，刘海，张淑琴，张晓晴

(武汉科技大学 资源与环境工程学院，湖北 武汉，430080)

为了提高漆酶的稳定性，研究了甘油、肌醇和山梨醇3种添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响，并通过紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱分析了添加剂对漆酶的保护机理。研究表明，添加剂对漆酶的保护效果与添加剂的种类和浓度有关。在pH 3的缓冲液中，当肌醇的浓度为0.2 mol/L时漆酶的相对酶活达到最大值(125%)，当甘油或山梨醇浓度增加时，漆酶的相对酶活逐渐增大；当添加的浓度相同时，甘油对漆酶的保护效果强于山梨醇，当添加的浓度为0.6 mol/L时，甘油使漆酶相对酶活提高了29%，山梨醇使漆酶相对酶活提高了15%。漆酶适宜的pH值范围为2～5，加入添加剂后提高了漆酶的酸碱稳定性。通过光谱分析可知，通过与漆酶分子间形成氢键，甘油、肌醇和山梨醇可以提高漆酶在溶液中的酸碱稳定性。

漆酶；稳定性；添加剂；保护机理

漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化降解多种酚类有机物[1]。漆酶催化底物比较广泛，可以应用于治理纺织印染废水、含酚废水和造纸工业废水[2]。虽然漆酶的催化底物广泛，但是由于天然漆酶的稳定性较差，在使用时易失活，限制了漆酶的实际应用[3]。因此，研究提高漆酶稳定性的方法对其实际应用具有重要意义。目前，酶稳定化的主要方法有化学修饰、非共价修饰、固定化和蛋白质工程等[4]。加入添加剂属于非共价修饰的方法，而多羟基化合物是添加剂中重要的一种。贾晓龙[5]研究了几种多羟基化合物对纤维素酶的影响，研究结果表明,多羟基化合物能够提高纤维素酶在极端pH值环境中的稳定性。陈亦等[6]研究发现，甘油通过提高溶液黏度和表面水化层，阻止酶分子间的聚集，可以提高胆固醇氧化酶的稳定性。叶双双[7]等考察了多种添加剂对苯丙氨酸羟化酶稳定性的影响，发现甘油、海藻糖、棉籽糖和甘露醇均能提高苯丙氨酸羟化酶的酶活保留率。本项目选择甘油、肌醇和山梨醇3种添加剂对漆酶的酸碱稳定性进行研究，对拓宽漆酶的使用范围具有重要意义。通过紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱探讨了添加剂对漆酶的保护机理，为添加剂保护漆酶提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二氨盐(2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)、漆酶(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；肌醇、山梨醇和甘油(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

PB-10型pH计，德国Sartorius公司；UV-2550紫外可见分光光度计，日本津岛公司；FP-6500荧光光谱仪和J-810圆二色谱仪，日本Jasco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 漆酶溶液和添加剂溶液的配置

选择NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系，并用H3PO4和NaOH调节酸碱度，配置成pH值为pH 2～7的缓冲液，缓冲液质量浓度均为0.01 mg/mL。分别用不同pH值的缓冲液配制添加剂溶液，其中肌醇、山梨醇和甘油各配置成浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mol/L。用不同pH值的缓冲液配制漆酶溶液，使漆酶的质量浓度为0.2 mg/mL。将pH值相同的添加剂溶液和漆酶溶液等体积混合，放置24 h后测定不同pH值的混合液的相对酶活，同时取样测定荧光光谱、圆二色谱和紫外光谱。

1.3.2 酶活力的测定

采用ABTS比色法测定漆酶的酶活[8]。先加入2 mL酶液，最后加入1 mL 0.5 mmol/L ABTS于常温下启动反应，测定3 min内在420 nm处反应液的吸光度值的变化，以每分钟转化1 μmol底物定义为1个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的添加剂对漆酶酶活的影响

为了便于研究添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响，首先考察添加剂浓度对漆酶酶活的影响，确定添加剂的适宜浓度。在pH 3的漆酶溶液中加入不同浓度的添加剂，测定其酶活并与未加添加剂的漆酶溶液比较，计算漆酶的相对酶活。

从图1可知，随着肌醇浓度的增加，漆酶的相对酶活先增大后减小。当肌醇的浓度达到0.2 mol/L时，漆酶的相对酶活达到最大，故肌醇的适宜浓度为0.2 mol/L。加入过量的肌醇，漆酶的活性反而降低，这可能是由于过量的肌醇会阻碍漆酶与ABTS结合，进而使酶活性降低。刘彩琴[9]等人的研究结果也表明加入过多的添加剂会使酶活性下降。添加甘油和山梨醇的相对酶活曲线较为相似，都是随着浓度的上升，漆酶的相对酶活逐渐增大，当添加的浓度相同时加入甘油后漆酶的相对酶活大于加入山梨醇，说明甘油的效果强于山梨醇。当甘油或山梨醇的添加量达到0.6 mol/L时，加入甘油时漆酶相对酶活提高了29%，加入山梨醇后提高了15%。在考察的浓度范围内由于甘油和山梨醇的相对酶活曲线没有出现极值，因此我们以0.6 mol/L作为甘油和山梨醇的适宜浓度，考察其对漆酶的保护效果。从图1我们还可看出，添加剂对漆酶的保护效果与添加剂的类型和浓度有关，因此选择合适的添加剂及其适宜的浓度对其在实际中的应用具有十分重要的意义。

图1 加入添加剂后漆酶的相对酶活Fig.1 The relative enzyme activity of laccase after adding additives

2.2 添加剂对漆酶的酸碱稳定性的影响

从图2可知，随着溶液pH值的升高，漆酶的相对酶活先增大后减小，在溶液pH 3时漆酶的相对酶活达到最大值。漆酶的相对酶活在缓冲液pH 2～5时都维持在了100%以上，可以看出其适宜的pH值范围应该在pH 2～5。当溶液为pH 2～3时，加入甘油对漆酶的保护效果要好于山梨醇或肌醇，而在pH 4的溶液中加入山梨醇后漆酶的相对酶活高于甘油或肌醇。总的来说甘油的保护效果要好于山梨醇和肌醇，在pH 2和3的溶液中能使漆酶的相对酶活分别提高53%和120%。当溶液pH>5时漆酶的酶活下降较快，加入添加剂对漆酶的保护效果不明显。在pH 6的漆酶溶液中，加入添加剂后漆酶的相对酶活提高了不到10%。添加剂对漆酶的保护效果与漆酶的适宜pH值范围有关，当溶液pH值超过其适宜范围时，添加剂对漆酶的保护效果下降。从图2不难看出，添加剂可以提高漆酶在不同pH值溶液中的相对酶活，添加剂增强了漆酶的酸碱稳定性。

图2 加入添加剂后漆酶在不同pH溶液中的酶活Fig.2 Enzyme activity of laccase after adding additives in different pH solutions

2.3 添加剂对漆酶的保护机理

2.3.1 漆酶的紫外光谱分析

蛋白质的紫外光谱有190～220 nm和250～300 nm两个吸收峰区[10]。前者是肽基团的吸收峰区，后者主要是蛋白质中酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸的贡献[11-12]。由图3可知，随着pH值的升高，肽基团的吸收峰逐渐增强，并且吸收峰红移。增大pH值会诱导漆酶肽链伸展，埋藏在内部的肽基团会逐渐暴露到水中，进而使漆酶在溶液中的稳定性降低。本研究采用的漆酶分子含有33个苯丙氨酸，7个色氨酸和13个酪氨酸，从图3可以看出漆酶在290 nm处有特征吸收峰出现，但是吸收峰很微弱，无法通过紫外光谱分析溶液pH值对漆酶3种氨基酸残基的影响。图4是缓冲液pH 5时漆酶的紫外光谱，从中可以看出加入添加剂后肽键的吸收峰强度变弱了而且吸收峰红移。所选择的这3种添加剂都属于多羟基化合物，它们在溶液中与漆酶之间能形成氢键，当溶液pH值升高导致漆酶肽链伸展时，多羟基化合物与漆酶之间的这种相互作用力能够阻止这种不利影响。由于氢键的存在，添加剂增强了漆酶的酸碱稳定性。在290 nm处是由3种氨基酸吸收峰共同组成的，添加剂对这3种氨基酸残基微环境的影响无法通过紫外光谱进行区分。

图3 不同pH值下漆酶的紫外光谱Fig.3 UV spectra of laccase at different pH values

图4 加入添加剂后漆酶的紫外光谱Fig.4 The UV spectrum of the laccase after adding the additive

2.3.2 漆酶的荧光光谱分析

在漆酶分子中能发射荧光的主要是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸的荧光量子产量低，而酪氨酸的荧光由于常常被熄灭显得很弱[13-14]。因此，选择色氨酸的荧光来研究漆酶的构象变化。选择290 nm的激发波长可以避免其他2个氨基酸的干扰，方便研究漆酶中的色氨酸残基微环境的变化。从图5中可知，随着溶液pH值的上升，色氨酸残基的荧光强度逐渐增强，荧光光谱蓝移，最大吸收峰从343 nm移动到336 nm。这可能是因为当溶液pH值增大时，漆酶分子会发生去折叠过程进而使肽链得到伸展，从而使埋藏在漆酶分子内部的氨基酸残基暴露在极性溶剂中。这种变化会降低漆酶活性和漆酶的酸碱稳定性。图6是缓冲液pH 5时漆酶的荧光光谱，从中可以看出，加入多羟基化合物后色氨酸残基的荧光强度有不同程度下降，表明添加剂存在时不利于漆酶肽链的展开。最大吸收峰并没有发生蓝移或红移，说明当漆酶的氨基酸残基暴露于溶液中时，添加剂能够维持氨基酸残基微环境的稳定，抵抗溶液pH值变化对其造成的影响。这3种添加剂在水溶液中能与漆酶分子形成很多氢键，这些氢键的存在能使漆酶抵抗溶液pH值变化带来的不利影响，使漆酶的空间结构不被破坏，这是维持漆酶活性的重要原因。

图5 不同pH值下漆酶的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of laccase at different pH values

图6 加入添加剂后漆酶的荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectra of laccase after adding additives

2.3.3 漆酶的圆二色谱分析

蛋白质变性时往往发生α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲之间的相互转化[15-16]。利用圆二色谱可以研究漆酶二级结构的变化。其中α-螺旋结构在192 nm附近有一个正的特征峰，208和223 nm处有2个负的特征谱带；β-折叠在195～197 nm有正的特征峰，218 nm附近有负的特征谱带；β-转角在200～205 nm有正的吸收峰。

从图7可以看出，漆酶的二级结构主要以β-折叠和无规则卷曲为主，随着溶液pH值的变化这两种结构的含量也会发生变化。在pH 3的缓冲溶液中漆酶没有出现明显的β-折叠吸收峰，然而在pH值为5和7的漆酶溶液中出现了的β-折叠的吸收峰,但是其吸收峰很弱。本研究采用的是侧耳属漆酶，其等电点是4.51[17]，当溶液pH值低于等电点时漆酶产生净的正电荷，反之漆酶带负电荷。在蛋白质分子中不同基团间存在着静电作用(静电吸引或静电排斥)[18]，当溶液pH值改变时会导致漆酶分子上不同基团所带的电荷发生变化，由原来的静电吸引变成静电排斥。从图7中可以看出，pH值变大时漆酶的无规则卷曲会向β-折叠转变，静电排斥会导致漆酶构象改变，降低漆酶活性和漆酶的稳定性。

图7 不同pH值下漆酶的圆二色谱图Fig.7 The circular dichroism of laccase at different pH values

图8是缓冲液pH 5时漆酶的圆二色谱，从图8可知，加入添加剂后无规则卷曲的含量变高了，说明加入添加剂能够有效抑制pH值变化导致的静电作用对漆酶二级结构的影响，这可能是因为添加剂分子中的羟基与漆酶的酰胺基团能够形成氢键。通过与漆酶分子形成氢键，甘油、肌醇和山梨醇能够削弱溶液pH值变化导致的漆酶分子内部的静电排斥力，提高漆酶分子的稳定性。

图8 加入添加剂后漆酶的圆二色谱图Fig.8 The circular dichroism of the laccase after adding the additive

3 讨论

研究了不同浓度和种类的添加剂对漆酶酶活和酸碱稳定性的影响，同时探究了添加剂对漆酶的保护机理。添加剂对漆酶的保护效果不仅与添加剂的浓度有关，还与其种类有关。本研究选择的添加剂都属于多羟基化合物，其对漆酶存在不同的保护效果可能是由于这些添加剂分子中的羟基活跃度不一样，导致其与漆酶分子间形成的相互作用力不同，从而表现出不同的保护效果[19]。加入添加剂后漆酶的相对酶活提高了，添加剂的存在能增强其酸碱稳定性。本次选择的添加剂含有多个羟基，许多研究表明多羟基化合物能够提高酶的稳定性。如刘朝晖等[20]研究了几种多羟基化合物对β-甘露聚糖酶稳定性影响，其研究结果表明加入多羟基化合物能提高β-甘露聚糖酶的相对酶活，还能够提高β-甘露聚糖酶的半衰期。赵伟超等[21]的研究发现甘油、葡萄糖和明胶能够有效促进重组普鲁兰酶的稳定性。本实验也得到了同样的结论，加入甘油、肌醇和山梨醇这类多羟基化合物能提高漆酶在溶液中的稳定性。溶液pH值变化时会导致漆酶分子内部基团所带电荷发生变化，静电作用会使漆酶构象发生变化，同时溶液pH值的变化也会诱导漆酶分子肽链伸展，使原本在疏水环境中的氨基酸残基暴露于溶液中，进而导致漆酶失活。本次选择的3种添加剂能在溶液中与漆酶形成氢键，正是由于这些氢键的存在，使得当溶液pH值变化时漆酶仍能够保持正确的空间结构。因此，加入添加剂能够提高漆酶的酸碱稳定性。综上，添加剂对漆酶的保护效果与添加剂的种类和浓度有关，本次采用的3种添加剂能在溶液中与漆酶分子间形成氢键，氢键的存在能够提高漆酶的稳定性。通过考察添加剂对漆酶稳定性的影响，分析添加剂对漆酶的影响机理，为添加剂提高漆酶的稳定性提供参考。

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Effectandprotectionmechanismofadditivesonacid-basestabilityoflaccase

HE Xiao-yong,REN Da-jun*,DENG Zhi-qun,LIU Hai,ZHANG Shu-qin,ZHANG Xiao-qing

(College of Resources and Environmental Engineering,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430080,China)

In order to improve the stability of laccase,the effects of three additives (glycerol,inositol and sorbitol) on the acid-base stability of laccase were studied,and the protection mechanism of the additives on laccase was analyzed by UV spectroscopy,fluorescence spectroscopy and circular dichroism.The results indicated that the protective effect of the additives on laccase was related to the type and concentration of the additives.When the concentration of inositol was 0.2 mol/L in buffer at pH=3,the relative activity of laccase reached the maximum (125%).With increasing of the concentration of glycerol or sorbitol,the relative activity of laccase increased gradually.When the concentration was 0.6 mol/L,glycerol increased the relative activity of laccase by 29%,and sorbitol increased the relative activity of laccase by 15%.The optimum pH range for laccase should be pH 2 to 5,and use of additives could improve the acidity of laccase.Spectral analysis showed that these additives could form hydrogen bonds with laccase molecules in the solution,resulting in the improvement on the acid-base stability of laccase.

laccase; stability; additives; protection mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015196

硕士研究生(任大军教授为通讯作者，E-mail：dj_ren@163.com)。

国家自然科学基金面上项目(41571306)

2017-07-14，改回日期：2017-08-29