常见食品组分及金属离子对落新妇苷稳定性的影响

张丽，上官新晨，尹忠平，张清峰

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌,330045)

常见食品组分及金属离子对落新妇苷稳定性的影响

张丽，上官新晨，尹忠平，张清峰*

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌,330045)

黄酮落新妇苷不稳定，在中性和弱碱性条件下易发生异构化和分解反应，该文利用HPLC研究了常见食品组分及金属离子对落新妇苷稳定性的影响。研究结果表明，常见食品添加剂VC、蔗糖和β-CD可以提高落新妇苷的稳定性，而苯甲酸钠无明显影响。β-CD通过包结反应同时抑制落新妇苷异构化和分解反应；而VC和蔗糖则会加速落新妇苷的异构化，但抑制其分解反应。Al3+、Mg2+、Ca2+、Na+、K+等金属离子可以轻微增强落新妇苷的稳定性，其中Na+效果较好。Fe3+会显著促进落新妇苷分解反应，降低其稳定性; 而Al3+可完全抑制落新妇苷的异构化反应，但对其分解反应无影响。食品组分蛋白质和淀粉对落新妇苷的稳定性影响不大，其中牛血清蛋白轻微增强其稳定性，而淀粉有轻微的减弱作用。

落新妇苷；异构化；分解；稳定性

落新妇苷是一种广泛存在于植物中的二氢黄酮类化合物，在许多水果、中药及其加工食品中都有发现，如葡萄[1]、土茯苓[2-3]、、黄杞叶(罗汉茶)[4]、葡萄酒[1]、龟苓膏[5]等。已有研究表明落新妇苷具有多种显著的生物学活性，包括强抗氧化活性、降血糖、调节脂肪代谢、选择性免疫抑制等[6]。

黄酮类化合物通常较不稳定，热、光、pH等外界环境因素都可能引起其降解，并与其化学结构有密切关系[7]。MAINI等比较了4种黄酮，高良姜精、山柰酚、槲皮素、杨梅素在紫外光照射及不同培养基溶液中的稳定性，结果表明黄酮稳定性与B环上羟基数目有关，羟基数目越多则越不稳定[7]。本课题组前期研究发现不同品牌龟苓膏中落新妇苷含量差异巨大，有些甚至没有，一个可能原因是不合适的生产工艺和贮藏条件导致了落新妇苷的降解[5]。LANDRAULT等发现葡萄酒中落新妇苷含量随其贮藏、陈化时间而发生变化[1]，但未给出原因。作者前期通过HPLC研究了温度、pH、溶剂等因素对落新妇苷单体稳定性的影响[8]。然而，食品中的落新妇苷不是单独存在的。因此，本文研究常见的食品组分及金属离子对落新妇苷稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

落新妇苷由本实验室从土茯苓中纯化，经 UV、IR、MS and NMR 鉴定，纯度>98%；分析纯NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuSO4、FeCl3、AlCl3、ZnCl2、苯甲酸钠、抗坏血酸、甲醇、可溶性淀粉等,购自天津永大化学试剂有限公司；蔗糖(食用级)，购自安琪酵母(赤峰)有限公司；β-环糊精(β-CD)，购自江苏丰园生物技术有限公司；牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)：(分析纯)，购自上海晶纯生化科技股份有限公司；色谱纯乙腈,购自RCI Labscan (Bangkok,Thailand)。

1.2 仪器与设备

HPLC为安捷伦1260系统，配自动进样器和二极管阵列检测器；色谱柱为Waters Symmatry C18柱 (250 mm×4.6mm i.d.,5μm)；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

HPLC流动相为乙腈(A)及 0.1%醋酸水溶液(B)。线性梯度程序为0～15 min，16%～21% A；15～40 min，21%～40% A。流速为1 mL/min，进样量 10 μL，检测波长为 291 nm。

1.3.2 落新妇苷标准溶液的配制

精确称取20 mg落新妇苷，用体积分数50%的甲醇溶解，定容于10 mL的容量瓶中，得到2 mg/mL的落新妇苷标准溶液，放置于4 ℃冰箱备用。同样步骤配制浓度为10 mg/mL的落新妇苷标准溶液，放置于4 ℃冰箱备用。

1.3.3 食品添加剂对落新妇苷稳定性的影响

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸缓冲液将2 mg/mL的落新妇苷标准溶液稀释10倍，分别与用双蒸水配制的20 mmol抗坏血酸、10%蔗糖、20 mmol/L苯甲酸钠、1% β-CD等体积混合后，放置于45 ℃水浴中，每间隔1 h取样，经0.45 μm滤膜过滤后用HPLC测定溶液中剩余落新妇苷的浓度及其异构体的浓度。

1.3.4 金属离子对落新妇苷稳定性的影响

用双蒸水将2 mg/mL的落新妇苷标准溶液稀释10倍，分别与浓度都为2 mmol/L的Mg2+、Cu2+、Ca2+、 Na+、K+、Fe3+、Al3+、Zn2+等金属离子溶液(双蒸水配制)等体积混合。放置于45 ℃水浴中，每间隔1 h取样，经0.45 μm滤膜过滤后用用HPLC测定溶液中剩余落新妇苷的浓度及其异构体的浓度。

1.3.5 牛血清蛋白和淀粉对落新妇苷稳定性的影响

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸缓冲液将10 mg/mL的落新妇苷标准溶液稀释10倍，取此溶液2.5 mL与2%的牛血清蛋白溶液或淀粉溶液等体积混合，放置于45 ℃水浴中，每间隔1 h取样0.2 ml，加入0.8 mL的纯甲醇，涡旋混匀5 min,10 000 r/min离心5 min，过0.45 μm滤膜后用HPLC测定溶液中剩余落新妇苷的浓度及其异构体的浓度。

1.4 分解速率常数和半衰期计算

根据不同时间HPLC测定的落新妇苷浓度，用一级数学模型模拟落新妇苷的分解动力学，计算落新妇苷及其异构体在不同条件的分解速率常数和半衰期，具体公式为[8]：

ln(Ct/C0)=-k×t

(1)

t1/2=-ln0.5×k-1

(2)

式中:C0为落新妇苷初始浓度；Ct为t时刻落新妇苷及其异构体浓度之和；k为降解速率常数；t1/2为半衰期。

1.5 数据统计

实验平行重复2次，取平均值，使用Origin 8.0 (Origin Lab Co.,Northampton,MA,USA)软件进行数据统计分析、计算、绘图和曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 常见食品添加剂对落新妇苷稳定性的影响

根据落新妇苷分子结构，其在C2和C3位上存在立体异构现象，分别有2(R):3(R) (落新妇苷)、2(S):3(S)(新落新妇苷)、2(S):3(R)(新异落新妇苷)和2(R):3(S) (异落新妇苷)4种顺、反异构体[9]。在前期研究中，发现pH和温度会显著影响落新妇苷异构化和分解反应，主要异构化产物为新异落新妇苷。在酸性条件下，落新妇苷很稳定；在中性和弱碱性条件下以异构化为主，分解速率较慢；当pH值大于10后几乎不发生异构化而直接分解。温度升高会加快落新妇苷的异构化和分解速率[8]。因此本文不再考察温度和pH的影响，在45 ℃，pH 8.0固定条件下研究常见食品添加剂苯甲酸钠、VC、蔗糖、β-CD对落新妇苷异构化和分解的影响。

图1-A为不同食品添加剂对落新妇苷保留率的影响。

与对照相比，VC、蔗糖、β-CD都可显著提升落新妇苷的保留率，β-CD效果最为显著，VC其次；而常用防腐剂苯甲酸钠无任何影响。减少的落新妇苷除发生分解外，一部分转化为其异构体新异落新妇苷(图1-D中峰2)。图1-B为新异落新妇苷的生成情况。无添加剂条件下，2 h时约有25%的新异落新妇苷生成，随后其含量逐渐减少，说明新异落新妇苷也在逐渐分解。与对照相比，β-CD显著抑制落新妇苷的异构化，新异落新妇苷的最大生成量仅为10%；而VC和蔗糖则加速新异落新妇苷的生成，最大生成量达到35%。图1-C为落新妇苷和新异落新妇苷浓度之和随时间的变化曲线，反映其分解情况。VC、蔗糖和β-CD可显著减少落新妇苷和新异落新妇苷的分解。对照条件下，10 h后落新妇苷和新异落新妇苷浓度之和仅为落新妇苷初始浓度的33%；而VC组为74.5%；蔗糖与β-CD效果相当，保留率为53%。落新妇苷及其异构体的具体分解产物还不明确。MAINI等通过液质联用技术分析了槲皮素、山柰酚等黄酮的主要分解产物，主要为三羟基苯及苯甲酸类衍生物[7]。

表1为由图1-C数据通过一级数学模型拟合得到的落新妇苷和新异落新妇苷的分解动力学参数。45 ℃条件下，在pH 8.0的磷酸缓冲液中，落新妇苷和新异落新妇苷的分解速率常数为0.132 0，分解半衰期为5.25 h。在溶液中添加VC可有效提高落新妇苷和新异落新妇苷的稳定性，抑制其分解，分解速率常数减少至为0.023 1，分解半衰期延长至30 h。β-CD和蔗糖抑制落新妇苷和新异落新妇苷分解的效果相当，而苯甲酸钠没有影响。β-CD 具有特殊的外亲水内疏水的空腔结构，空腔大小适中，可与落新妇苷形成络合物[10]。因此，β-CD抑制落新妇苷异构化和分解的机制应该是源于其空腔的保护作用。由于β-CD与落新妇苷络合物的形成常数随着温度的降低而增大，因此，在低温条件下β-CD提升落新妇苷稳定性的效果会更佳。VC和蔗糖可以加速落新妇苷异构化，同时抑制其分解，但机制还不明确，将在后续研究中展开。

A-落新妇苷保留率；B-落新妇苷异构体的生成情况；C-落新妇苷及其异构体分解；D-储存4 h后落新妇苷不同条件下的HPLC色谱图。峰1-落新妇苷，峰2-新异落新妇苷。□-空白对照；○-VC;△-蔗糖；▽-苯甲酸钠；◇-β-CD图1 常见食品添加剂对落新妇苷稳定性的影响Fig.1 The effect of different food additives on the stability of astilbin

注：—，溶液体系中有Fe3+时，落新妇苷分解过快，无法计算其半衰期。

2.2 常见金属离子对落新妇苷稳定性的影响

图2为食品中常见金属离子对落新妇苷稳定性的影响。图2-A表明本实验测试的大部分金属离子有提高落新妇苷保留率的作用。但Fe3+使溶液中落新妇苷的含量迅速减少。图2-B说明大部分金属离子可抑制落新妇苷的异构化，减少新异落新妇苷的生成量，从而提升落新妇苷的保留率，效果最为明显的是Fe3+和Al3+，10h内落新妇苷异构体的生成量几乎为零；Mg2+、Ca2+、Cu2+、 Na+、K+等也能延缓落新妇苷异构体的形成，而Zn2+几乎没有影响。图2-C反映不同金属离子存在条件下落新妇苷和新异落新妇苷的分解情况。结合表1的分解速率常数和半衰期拟合数据，结果表明Al3+、Mg2+、Ca2+、 Na+、K+等金属离子可以轻微延缓落新妇苷及其异构体的分解，具有增稳作用，其中Na+效果相对较好，使落新妇苷的半衰期延长了2.2倍；Cu2+、Zn2+和Fe3+会加速落新妇苷及其异构体的分解。特别是Fe3+促进落新妇苷分解的效果特别明显，加入Fe3+1 h后，仅剩余不到25%的落新妇苷。图2-D为Fe3+存在条件下5 h时落新妇苷的HPLC色谱图，未发现新异落新妇苷的的生成，说明Fe3 +直接促使落新妇苷发生分解而非异构化。这可能是因为落新妇苷结构中存在酚羟基，具有抗氧化作用，而Fe3+具有氧化性，因此能迅速破坏落新妇苷的结构，降低其稳定性。而Al3+能够完全抑制落新妇苷异构化的机制还不明确。

A-落新妇苷保留率；B-落新妇苷异构体的生成情况；C-落新妇苷及其异构体分解情况；D-储存5 h后落新妇苷在在对照和含Fe3+溶液中的HPLC色谱图，峰1-落新妇苷，峰2-新异落新妇苷图2 常见金属离子对落新妇苷稳定性的影响Fig.2 The effect of different metal ions on the stability of astilbin

2.3 牛血清蛋白和淀粉对落新妇苷稳定性的影响

蛋白质和多糖是大多食品中的主要组分。图3-A结果表明，在有牛血清蛋白的体系中，落新妇苷的保留率轻微高于对照组，而在淀粉体系中，落新妇苷的保留率轻微低于对照组。图3-B为落新妇苷异构体形成情况，牛血清蛋白能够促进落新妇苷异构体的形成，而淀粉能够延缓落新妇苷的发生异构化。图3-C为落新妇苷及其异构体的分解情况。结合表1的分解速率常数和半衰期拟合数据，结果表明牛血清蛋白可以轻微延缓落新妇苷及其异构体的分解，具有增稳作用，使落新妇苷的半衰期延长了2 h。蛋白质对落新妇苷的增稳作用可能是因为黄酮类物质与蛋白质有较好的亲和性，能形成复合物。方茹等研究发现在牛血清蛋白能通过氢键与黄酮结合，在有牛血清蛋白体系中黄酮的稳定性得到增强作用[11]。淀粉会促进落新妇苷及其异构体的分解，但作用机制还不明确。

A-落新妇苷保留率；B-落新妇苷异构体的生成情况；C-落新妇苷及其异构体分解情况图3 牛血清蛋白和淀粉对落新妇苷稳定性的影响Fig.3 The effect of bovine serum albumin and starch on the stability of astilbin

3 结论

实验结果表明，常见食品添加剂VC、蔗糖、β-CD对落新妇苷有增稳作用，而常用防腐剂苯甲酸钠无作用。其中β-CD能同时抑制落新妇苷的异构化分解反应；而VC和蔗糖会促进落新妇苷发生异构化，但抑制其分解。Cu2+、Zn2+和Fe3+会降低落新妇苷的稳定性，其中Fe3+使落新妇苷迅速分解；Al3+会完全抑制落新妇苷的异构化反应，但对其分解反应无影响；Na+对落新妇苷有一定的增稳作用。牛血清蛋白能轻微提高落新妇苷的稳定性，而淀粉则对落新妇苷的分解有轻微促进作用。落新妇苷有多种显著的生物活性，在贮藏和加工含落新妇苷食品时，应尽量避免不利因素，减少落新妇苷的分解，最大程度地发挥其生物功效。

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Effectoffoodcomponentsandmetalionsonthestabilityofastilbin

ZHANG Li，SHANGGUAN Xin-chen,YIN Zhong-ping，ZHANG Qing-feng*

(Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food,College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Astilbin is an unstable dihydroflavonol and easy to be isomerization and decomposed under neutral and weak alkaline medium.In the present study,the effects of different food components on the stability of astilbin was studied by HPLC.The results showed that common food additives VC,saccharose and β-cyclodextrin (β-CD) could significantly improve stability,while sodium benzoate has no effect.It is found that β-CD could suppress isomerization and decomposition of astilbin through complexation; while VCand saccharose accelerate the isomerization but suppress the decomposition.Metal ions,such as Al3+，Mg2+，Ca2+，Na+，K+could slightly improve the stability of astilbin,and Na+showed the best effect.Fe3+significantly improved the decomposition of astilbin but decreased its stability; Al3+completely inhibited the isomerization of astilbin but has no effect on its decomposition.The major components of food,protein (bovine serum albumin) and starch,have slight effects on the stability of astilbin.

astilbin; isomerization; decomposition; stability

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013399

硕士研究生(张清峰副教授为通讯作者，E-mail：zhqf619@126.com)。

国家自然科学基金项目(31760461)；江西省教育厅基金项目(GJJ160416)；江西省天然产物与功能食品重点实验室开放基金项目(2015003)

2016-11-14，改回日期：2017-09-21