黄根单体对大鼠肝星状细胞增殖和抑制作用及诱导其凋亡的影响*

杨增艳 赵湘培 柏春晖 韦金育 黄 鑫

1.广西民族医药研究院 (广西 南宁， 530001) 2.广西维康医药研究所

黄根单体对大鼠肝星状细胞增殖和抑制作用及诱导其凋亡的影响*

杨增艳1赵湘培1柏春晖1韦金育2黄 鑫1

1.广西民族医药研究院 (广西 南宁， 530001) 2.广西维康医药研究所

目的：研究黄根单体(HG2、HG3、HG4)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖的抑制作用以及诱导其凋亡的影响。方法采用四甲噻唑蓝(MTT)法检测黄根单体对HSC-T6的增殖的抑制作用，并运用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果单体HG3可诱导HSC-6发生凋亡，对其增殖具有抑制作用，且具有剂量依赖性；而单体HG2和单体HG4对大鼠HSC-6表现出较弱的抑制和诱导凋亡作用。结论黄根的蒽醌类成分能抑制HSC-T6细胞增殖并诱导其发生凋亡，从而发挥抗肝纤维化作用。

黄根；单体；肝星状细胞；增殖；抑制;凋亡

黄根来源于茜草科植物南山花PrismatomerisconnataY. Z. Ruan.的根，又名狗骨木、南山花、三角瓣花，是广西特色壮药材之一[1]。具有利湿退黄、强筋壮骨、祛瘀生新、凉血止血等功效，可用于风湿骨痛、跌打损伤、白血病、矽肺、贫血、牙龈出血、尿路感染等病的治疗[2]。现代文献报道，黄根的化学成分主要有1-羟基-2-甲基蒽醌、2-羟基-3-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌、甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、虎刺醛和B-谷甾醇,在其叶中还含有熊果酸、B-sitosteryl-3-D-B-D-glucopyranoside[3～5]。

本课题组前期已发现黄根乙酸乙酯部位在体外能抑制大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖[6]；乙酸乙酯部位可降低肝纤维化大鼠的肝脏系数和AST水平，具有保肝护肝作用[7]。课题组进而对乙酸乙酯部位浸膏经反复的硅胶柱色谱及Sephadex LH-20柱色谱进行分离纯化，分离并鉴定了7个化合物，分别为东莨菪内酯(HG2)、豆甾-4-烯-3-酮、去甲虎刺醛、2-羟甲基-3-羟基-9,10-蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚(HG3) 、甲基异茜草素(HG4)、胡萝卜苷[8]。为进一步明确黄根抗肝纤维化的有效成分，课题组开展HG2、HG3和HG4三个单体化合物对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖的抑制作用以及诱导其凋亡的研究。

1 材料与方法

1.1 受试化合物与提取 黄根采自广西壮族自治区防城市，经广西民族医药研究院兰日春副主任药师鉴定为南山花的干燥根。60 kg黄根的根部用95%乙醇回流提取3次，每次 3小时，浓缩后得到浸膏 1200 g，加入适量的水使之充分溶解，水溶液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩得石油醚萃取浸膏58 g、乙酸乙酯萃取浸膏 112g 和正丁醇萃取浸膏 200 g。将乙酸乙酯浸膏112 g，经硅胶(200～300目)柱色谱，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱,收集各流分。Fr.2-3 经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离纯化得化合物HG2 (60mg), Fr.7-9 经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离纯化得化合物HG4(22 mg)，Fr.11经硅胶柱色谱分离纯化得化合物 HG3(35mg)。经结构鉴定，HG2为东莨菪内酯，HG3为甲基异茜草素-1-甲醚，HG4为甲基异茜草素[8]。HG2、HG3、HG4均溶于DMSO中，给药终浓度时DMSO不超过0.1%。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、0.25%Trypsin(Gibco公司)、MTT(sigma公司)、FITC-labeled Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)。FlexStation 3 微孔板检测系统(Molecular Devices，美国)、CDX41倒置显微镜(Olympus,日本)、CJ820标准净化工作台(苏洁净化设备厂，中国)、二氧化碳培养箱(Binder，德国)、流式细胞仪(BD，美国)。

1.3 细胞株及细胞培养 HSC-T6由北京市药检所提供，为SV40转染SD大鼠HSC，其表型为活化的HSC。细胞于37℃、5%CO2培养箱内，以含10%小牛血清的DMEM培养液在培养瓶内单层传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.4 MTT法检测HSC-T6细胞增殖的抑制 取对数生长期的大鼠HSC-T6，接种96孔板中(细胞密度4×104cell/ml)，每孔100 μl，各给药组设6个复孔。即空白对照组(含0.1%DMSO)、秋水仙碱组(Colchicine ，3 μg/ml)、HG2组(12.5、25、50、100、200 μg/ml)、HG3组(1.25、2.5、5、10、20 μg/ml)和HG4组(1.25、2.5、5、10、20 μg/ml)，此外，设立本底孔。处理48 h后，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，平面混合后，置于培养箱中继续孵育4 h，然后弃去各孔中的上清液，再加入100 μl DMSO，平面震荡混匀10 min，待其各孔中的蓝紫色甲瓒沉淀完全溶解后，置于酶标仪下测定各孔中的OD值(λ554 nm，全波长扫描结果显示554nm处OD值最大，故选554nm处所得值)，给药组样品OD值均需减去本底孔样品OD值。按下面公式计算细胞增殖抑制率IR：IR(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次。

1.5 HSC-T6细胞凋亡的检测 取对数生长期的大鼠HSC-T6，接种96孔板中(细胞密度4×104cell/ml)，每孔2 ml，设空白对照组(含0.1%DMSO)、秋水仙碱组(3 μg/ml)、HG2(200 μg/ml)、HG3(20 μg/ml)、HG4(20 μg/ml)，处理48h后，胰酶消化，收集细胞并按照FITC-labeled Annexin V/PI凋亡检测试剂盒使用说明书处理，所有处理过的细胞均用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 各组药物对HSC-T6细胞增殖的抑制情况 与空白组比较，HG2给药组和HG4给药组的最高剂量对HSC-T6细胞的增殖有微弱的抑制作用，而HG3对HSC-T6细胞显示出一定的细胞毒性，并且随着药物浓度的增加，HSC-T6的增殖活力下降，抑制作用增强，呈现剂量的依赖性。见表1、 表2、表3。

表1 各组药物对HSC-T6增殖抑制比较

与空白对照组比较，△△P<0.01；与秋水仙碱阳性组比较，**P<0.01

表2 各组药物对HSC-T6增殖抑制比较

与空白对照组比较，∆P<0.05，∆∆P<0.01；与秋水仙碱阳性组比较，**P<0.01

表3 各组药物对HSC-T6增殖抑制比较

与空白对照组比较，∆∆P<0.01；与秋水仙碱阳性组比较，**P<0.01

2.2 各组药物诱导HSC-T6细胞凋亡情况 见图1。 从图1可以看出， HG2和HG4给药组出现凋亡的细胞比例分别是7%和11.7%， HG3给药组发生凋亡的细胞比例达到28.6%。细胞凋亡实验结果与细胞增殖抑制实验结果较为吻合。

图1 各组药物诱导(流式细胞术)HSC-T6凋亡检测图

3 讨论

肝纤维化是由于炎症或损伤引起肝组织内细胞外基质增生，并过度沉积所造成肝细胞及其功能发生异常改变的病理变化。在这个变化过程中HSC发挥重要作用。在正常情况下，HSC位于窦周间隙，有储藏维生素A的功能。当肝脏慢性损伤发生时，HSC将从“静止状态”转为“激活状态”，激活后的HSC发生结构和功能性改变，不再储存维生素A，表达α-平滑肌肌动蛋白，并引起细胞外基质过度增生和沉积。激活后的HSC具有收缩、原始炎症和高增殖等特性[9]。因此，HSC的活化被认为是肝纤维化发生的核心环节。近年来国内外对抗肝纤维化的研究主要围绕抑制HSC的增殖，诱导HSC凋亡，促进细胞外基质降解方面进行[10]。

细胞凋亡是指维持细胞内环境稳定，由基因控制的细胞自主地有序性死亡，是多细胞有机体在细胞分化发育中及在各种生理、病理条件下起重要作用的一种调节适应过程。它是细胞死亡的一种形式，但与细胞坏死不同，细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控等方面，是一种主动行为过程[11]。活化后的HSC发生凋亡，细胞外基质生成减少，降解增加，有利于肝纤维化发生逆转。因此，诱导活化的HSC凋亡对抗肝纤维化具有积极意义。

本课题组在前期研究的基础上，对黄根中的东莨菪内酯、甲基异茜草素-1-甲醚和甲基异茜草素进行细胞实验研究，发现：①黄根中的甲基异茜草素-1-甲醚(HG3)可抑制大鼠HSC的增殖，也能诱导其发生凋亡，其作用大小与剂量正呈相关性；②黄根中的东莨菪内酯(HG2)、甲基异茜草素(HG4)无论是抑制HSC增殖还是诱导其凋亡均表现出较弱的作用。

综上所述，黄根的蒽醌类成份抗肝纤维化作用机制应与其能抑制HSC增殖并诱导其凋亡有关。通过抑制作用和诱导其凋亡，进而减少细胞外基质在肝组织内沉积，发挥抗肝纤维化作用。

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EffectofPrismatomerisconnataY.Z.Ruan.MonomersontheProliferationapoptosisinRatHepaticStellateCell

YANGZeng-yan1,ZHAOXiang-pei1,BAIChun-hui1,etal. 1.GuangxiNationalMedicalResearchInstitute(NanningGuangxi, 530001)China

Objective:To investigate the effects of Prismatomeris connata Y. Z. Ruan. Monomers on Rat Hepatic Stellate Cell (HSC-T6).MethodsMTT assay was used to evaluate the inhibitory effect of the drugs on HSC-T6 , flow cytometry were applied to measure the cell apoptosis.ResultsHG3 not only could inhibit proliferation of HSC-T6 cells in concentration manners,but also could induce apoptosis of HSC-T6 cells. HG2 and HG4 showed a slight effect on the Proliferation apoptosis in Rat Hepatic Stellate Cell.ConclusionThe Prismatomeris connata Y. Z. Ruan. Monomers can inhibit the proliferation of HSC-T6 cells and induce apoptosis, wihch show the therapeutical effects on hepatic fibrosis.

Prismatomeris connata Y. Z. Ruan.; Monomers ;hepatic stellate cells; Proliferation； inhibition; Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.012

国家自然科学基金课题(No.81260683)

2017-03-27 编辑：韦 怡)