PGK1基因沉默对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响*

张园园 方肇勤

上海中医药大学 基础医学院 (上海， 201203)

PGK1基因沉默对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响*

张园园 方肇勤△

上海中医药大学 基础医学院 (上海， 201203)

目的：观察PGK1基因沉默对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响。方法常规体外培养SMMC7721肝癌细胞，Lipofectamine 3000方法将shRNA-PGK1 质粒及阴性载体转染至SMMC7721细胞；荧光实时定量 PCR及 Western Blot 检测 PGK1 的表达，MTT 检测细胞相对存活率。结果与正常SMMC 7721 细胞相比，在PGK1沉默的肝癌细胞中，PGK1基因的表达降低，细胞的相对存活率减少。结论PGK1基因沉默能够抑制SMMC7721肝癌细胞的增殖。

肝癌细胞；PGK1；RNA干扰；细胞增殖

原发性肝癌(肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤死亡率中居第二位[1]，严重危害人民生命健康。一直以来，中医药都是我国肝癌防治的重要力量，中医药在减轻患者临床症状，配合放化疗减毒增效，保护肝脏，预防肿瘤发生、复发、转移，延长患者生存期等方面具有独特的优势。然而，中医药防治肝癌的研发基础相对薄弱，相关作用机制并不十分清楚。

近年来，本项目组在国家自然基金的连续资助下，经过长期的研究和探索发现，预知子在体外能够显著抑制SMMC7721肝癌细胞的恶性增殖，与细胞毒抗生素G418联用，具有减量增效的作用[2，3]；基因芯片检测结果显示，预知子的乙醇提取物能够有效减少肝癌细胞中包括PGK1在内的多种基因的表达，其与G418联用，下调PGK1表达的作用增强；qRTPCR结果也进一步证实了这一结果。由此，我们推测：预知子可能是通过下调PGK1的表达，减少肝癌细胞SMMC7721的恶性增殖。然而，国内外并无PGK1对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖影响的相关报道。因此，我们计划将含PGK1 RNAi片段的质粒转染入SMMC7721细胞，使PGK1表达后沉默，观察肝癌细胞的恶性增殖情况，以揭示两者关系，为进一步探讨预知子乙醇提取物防治肝癌的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要实验仪器 二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)、垂直式无菌无尘操作台(中国造鑫企业有限公司)、Step One 定量 PCR 仪(美国 ABI 公司)， 酶标仪(美国 Bio-TEX 公司)，Nanodrop 分光光度计(美国 Thermo 公司)，WB系统(美国BTO-RAD公司)。

1.1.2 主要实验试剂 Psilencer2.1-U6 neo载体质粒(美国Thermo 公司)、质粒双酶切试剂盒(美国NEB公司)，感受态细胞 DH5α、凝胶DNA回收试剂盒(天根生物科技有限公司)，TRizol、质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine3000 (美国 Invitrogen 公司)，MTT、 DMSO(美国sigma公司)，1640 培养基、胎牛血清、青链霉素双抗(美国 Gibco 公司)，鼠抗人 PGK1单克隆抗体、鼠抗人GAPDH 单克隆抗体、辣根过氧化物标记的羊抗鼠 Ig G 抗体、鼠抗人GAPDH 单克隆抗体(美国Abnova公司 )，氯仿、异丙醇(上海国药集团)，RT试剂盒、PCR 扩增试剂盒(日本 TaKaRa 公司)，RIPA裂解液(中)(碧云天公司)，PVDF膜(美国 Millipore 公司)。

1.1.3 细胞株 SMMC7721人肝癌细胞株为本实验室冻存的细胞，购自中科院上海细胞所。

1.2 方法

1.2.1 常规细胞复苏及培养 细胞复苏及培养参照文献[4]进行。

1.2.2 PGK1干扰序列及引物序列的设计与合成 根据PGK1基因序列(NM_000291.3)，采用美国Life公司在线软件设计sh RNA序列，采用在线软件设计引物序列，均交由美国Invitrogen公司合成，shRNA序列：5’-GCTCAACAACATGGAGATTGG-3’。阴性质粒由试剂盒提供。

采用Primer3(v.0.4.0)在线软件设计PCR引物，PGK1-F：5’-TCACTCGGGCTAAGCAGATT-3’；PGK1-R：5’-CAGTGCTCACATGGCTGACT-3’。内参以GAPDH为参照(GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；GAPDH-R：5’-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’)。

1.2.3 干扰质粒的重组与扩增 使用限制性内切酶(位点为BamHI、Hind III)切开质粒，经电泳鉴定酶切成功后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将质粒回收。使用T4噬菌体DNA连接酶将质粒与shRNA-PGK1连接，并转化至感受态细胞DH5α。在含50μg/ml 氨苄青霉素的LB培养基平板涂板，37℃过夜后挑选单克隆菌落，接种至含同样浓度氨苄青霉素的 LB培养基中，37℃，220 r/min，振荡过夜。次日，将少量菌液交由Invitrogen公司测序，余下菌液与等体积50%的消毒甘油(甘油加水稀释高压消毒)混匀后，放置-80℃冰箱保存。

收到公司测序结果后，与设计的shRNA-PGK1序列进行比对，确定一致后，使用Invitrogen公司的质粒中抽试剂盒，抽提重组质粒，Nanodrop检测质粒浓度，稀释至100ng/ul，放置-20℃冰箱保存。

1.2.4 实时荧光定量 PCR(q RT-PCR)检测 实验分成 4组：未转染的空白对照组(正常组)、G418对照组(G418组)、转染空载体的阴性对照组(阴性组)和转染PGK1重组质粒的实验组(PGK1RNAi组)。待细胞处于对数生长期时，常规收集细胞，调整细胞浓度为1.2×105个/ml，每孔2 ml，接种至6孔板，每组2个复孔。培养16～18 h，细胞密度约 80%时吸弃阴性对照孔及PGK1转染孔中原培养液，用 PBS 洗 1遍，更换为Opti-MEM培养基1.75ml。按照 Lipofectamine 3000 说明书要求，将 5 μl P3000和95ulOpti-MEM培养基充分混匀后再加入25ul(2.5 μg)重组质粒/阴性质粒，与含3.75ul Lipofectamine3000的Opti-MEM培养基125ul，充分混匀，室温静置 5 min，将250 μl混合液加入对应孔中，置于恒温培养箱中培养。转染 4 h 后，更换为及血清及双抗的 1640培养基。培养 24后，除空白对照组外，其余3组更换为含有1.4mg/ml G418的RPMI 1640培养基，48h后每孔加入1mlTRIzol。

按照 TRIzol说明书提取其总 RNA，并将所得的 RNA 溶解于 RNase Free H2O。Nanodrop分光光度计测量RNA 浓度及纯度，依据PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)说明书取1μg 总 RNA 作为反转录模板，产物cDNA 再根据TAKARA 公司SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)说明书进行q PCR 操作每组3个复孔，内参基因使用GAPDH。反应体系为 cDNA 2.0 μl、RT Mix 10.0 μl、10 μmol/ L 的上下游引物各0.4 μl、Dye 0.4 μl、dd H2O 6.8 μl。Real-time PCR 反应程序：95℃，30s；95℃，30s→60℃，30s，40个循环。

目的基因的相对表达量可以采用 ∆∆CT 法分析，以正常组作为对照样本。

△CT=目的基因 CT-内参 CT(其中 CT 值为扩增 n 个循环基因的荧光数值)。

△△CT=观察样本∆CT-对照样本∆CT=(观察样本目的基因 CT-观察样本内参 CT)-(对照样本目的基因 CT-对照样本内参 CT)。实验重复3次。

1.2.5 蛋白定量(Western blot)检测 6孔板接种SMMC7721细胞，分组及转染方法同上。吸弃各孔培养液，每孔加入120μl细胞蛋白裂解液 RIPA，充分裂解细胞，3 000 r/min 离心收集上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明，测定每个蛋白样品的蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离，电压80V，浓缩胶跑30min；电压110V，分离胶跑60min。将分离胶上蛋白转移到 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入相应一抗，4℃ 过夜，TBST 洗 3次，每次 10 min，加入过氧化物酶标记二抗，摇床摇 1.5 h，TBST 洗 3 遍，每次 10 min，最后进行ECL显色，凝胶成像系统拍照，分析目标蛋白的相对表达量，内参蛋白使用GAPDH。实验重复3次。

1.2.6 MTT法检测PGK1沉默对细胞增殖的影响 分组方法同上，常规体外培养SMMC7721细胞，待细胞处于对数生长期时，收集细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，每孔100μl，接种至4块96孔板中，每组5个复孔。培养16～18 h，第1块板加20μlMTT溶液孵育4h后，每孔更换为150μlDMSO，放置摇床上振荡10min，酶标仪检测 490 nm 的吸光度(OD 值)。其余3快板，吸弃阴性对照孔及PGK1转染孔中原培养液，用 PBS 洗 1遍，更换为Opti-MEM培养基100μl/孔。按照 Lipofectamine 3000 说明书要求，将 2.4μl P3000和45.6ulOpti-MEM培养基充分混匀后再加入12ul(1.2μg)重组质粒/阴性质粒，与含1.8ul Lipofectamine3000的Opti-MEM培养基60ul，充分混匀，室温静置 5 min，以10 μl/孔将混合液加入对应的孔中，置于恒温培养箱中培养。转染 4 h 后，更换为含血清及双抗的1640培养基。转染12h后，3块板中除空白对照组外，其余3组更换为含有1.4mg/ml G418的完全RPMI 1640培养基，并于转染后24h、48h、72h分别进行MTT检测。

2 结果

2.1 RTqPCR检测结果 转染72h后，PGK1RNAi组PGK1基因的相对表达量明显低于其余各组，有统计学差异(P<0.05)；而G418组PGK1基因的相对表达量则明显高于其余各组，比较有统计学差异(P<0.05)，见图1。

2.2 Western blot检测结果 转染72h后，PGK1RNAi组PGK1蛋白的相对表达量低于其余各组，见图2。

2.3 MTT检测结果 随着转染时间的延长，各组相比，G418组细胞的增殖速度最低，PGK1RNAi组细胞的增殖低于阴性组和正常组，见图3。

图1 各组细胞PGK1基因的相对表达图

图2 各组细胞PGK1基因的蛋白表达图

图3 各组细胞PGK1基因的增殖图

3 讨论

磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解过程中重要的催化酶之一，它可催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)的磷酸转位到ADP而生成ATP。在原核和真核生物中，PGK的立体结构高度保守，是典型的双域结构。人类的基因组中，PGK存在两种亚型，PGK1和PGK2，两者在功能上和结构上都很相似。PGK1是X连锁基因，在所有的体细胞中都有表达[4]。

德克萨斯大学MD安德森癌症中心证实，在缺氧应激、表皮生长因子受体(EGFR)活化或致癌基因KRas G12V/B-Raf V600E突变的情况下，PGK1会线粒体易位。进而导致线粒体中丙酮酸代谢被抑制，细胞质中丙酮酸生成的乳酸增多。线粒体PGK1的蛋白激酶活性在于它是三羧酸(TCA)循环将丙酮酸从线粒体分流到细胞质中以促进乳酸生成的关键。此外，功能研究表明，用线粒体易位缺陷的PGK1 S203A突变体替代内源性PGK1可显着降低原位移植在小鼠脑中的肿瘤的生长，这是由肿瘤细胞低增殖率和增强的凋亡引起的[5]。由此可见，PGK1作为糖酵解酶和蛋白激酶在肿瘤的能量代谢方面发挥着重要的作用，其在恶性肿瘤组织中高度表达，有助于满足恶性肿瘤快速生长的需求。

本研究提示，在体外培养的肝癌细胞中，抑制PGK1基因的表达能够减少肝癌细胞的增殖。若要进一步阐明PGK1基因在肝癌发生发展过程中的作用，还需要更多的体内实验研究的支持。

[1] 陈万青,郑荣寿,曾红梅,等. 2011年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2015,24(1):1-10.

[2] 任红艳,方肇勤,梁超,等.预知子、白花蛇舌草抑制肝癌细胞恶性增殖的研究[J].辽宁中医杂志,2013,40 (12):2553-2555.

[3] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001：128-138,705-749.

[4] Beutler E.PGK deficiency[J]. Br J Haematol， 2007,136(1):3-11.

[5] Li X, Jiang Y, Meisenhelder J,etal. Mitochondria-Translocated PGK1 Functions as a Protein Kinase to Coordinate Glycolysis and the TCA Cycle in Tumorigenesis[J]. Mol Cell， 2016,61(5):705-719.

EffectofPGK1silencingontheproliferationofSMMC7721hepatomacells

ZHANGYuan-yuan,FANGzhao-qin△.BasicMedicalSchool,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine(Shanghai,201203)China

ObjectiveTo investigate the effect of PGK1 gene silencing on the proliferation of SMMC7721 hepatoma cells.MethodsSMMC7721 hepatoma cells were cultured in vitro. Lipofectamine 3000 was used to transfect shRNA-PGK1 plasmid and SMMC7721 cells into SMMC7721 cells. The expression of PGK1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot. Cell viability was measured by MTT.ResultsCompared with normal 7721 cells, the expression of PGK1 in PGK1-silenced HCC cells was significantly decreased and the relative survival rate of PGK1 cells was decreased.ConclusionPGK1 gene silencing can inhibit the proliferation of SMMC7721 hepatoma cells.

Hepatocarcinoma cell; PGK1; RNA interference; Cell proliferation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.013

国家自然科学基金(No.81273641);中国博士后科学基金(No.2013M531201);上海市科委博士后科研基金项目(No.13R21415900);上海高校青年教师培养资助计划(No.ZZszy13004)；△通迅作者

2017-03-22 编辑：程良斌)