一种萃取酒醅中低沸点挥发性成分的方法

郭家秀，张宿义，赵金松，3，，吴卫宇，苏占元，杨建刚*

（1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000；4.国家酒类产品质量监督检验中心，四川 泸州 646000）

一种萃取酒醅中低沸点挥发性成分的方法

郭家秀1，张宿义2，3，赵金松1，3，4，吴卫宇4，苏占元4，杨建刚1*

（1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000；4.国家酒类产品质量监督检验中心，四川 泸州 646000）

分别采用水蒸汽蒸馏（SD）法、超声辅助溶剂萃取（UASE）法和蒸馏-微溶剂萃取（SD-MSE）法从浓香型白酒酒醅中提取挥发性成分，利用峰面积归一化法测定各成分的相对含量，通过对挥发性成分的气相色谱-质谱连用/自动化退卷积系统（GC-MS/AMDIS）对比分析。结果表明，SD、UASE及SD-MSE法分别鉴定出42种、71种、60种挥发性成分。SD、UASE及SD-MSE法分别测得的醇、酸、酯的相对含量分别为1.34%、6.61%、21.67%；1.03%、39.28%、37.42%；3.96%、9.97%、64.97%。由此可知，SD法对酸、酯的提取效果劣于另两种方法，UASE法对酸类物质萃取效果更佳，SD-MSE法对酯类物质的萃取效果更佳。和UASE法相比，SD-MSE法节约了大量溶剂，减少了样品转移次数，且待测液澄清透明，是一种适宜萃取糟醅中低沸点成分的方法。

水蒸汽蒸馏法；超声辅助溶剂萃取法；蒸馏-微溶剂萃取法；气相色谱-质谱连用/自动化退卷积

中国白酒是世界著名的蒸馏酒之一，它独特的生产工艺是千百年来我国劳动人民生产经验的总结和智慧的结晶[1]。我国白酒历史悠长，分布广泛，由于技术发展、原料改变、生产工艺的差异以及不同地区人们对不同白酒的喜爱，形成了我国白酒种类繁多、风格多样的特点[2]。白酒中的微量成分虽然含量极少，但对酒质却有很大影响，决定着白酒的香气和口味，构成白酒的香型和风格，故风味物质近年来一直是研究的热点。

浓香型白酒又称泸香型酒，是中国白酒中的一朵奇葩，占据较大的市场份额。酒醅在发酵过程中产生的风味物质，与成品酒的风味物质有密切的关系，因此也是科研者关注的对象。然而固态发酵酒醅是非常复杂且不均匀的物质体系，除55%左右的水分和4%左右的乙醇外，还有粮食皮壳、残余淀粉、糖类、蛋白质、氨基酸以及无机盐等，但种类众多的香味成分的含量却很低。由于酒醅与白酒的质量比约为（15～30）∶1，所以酒醅中香味成分的含量仅相当于白酒中的1/20左右[3]，使得酒醅中各微量香味成分的提取及定量检测难以进行。因此，探索酒醅中香味成分的提取检测方法具有十分重要的意义。

自动质谱退卷积定性系统（automated mass spectral deconvolution&identification system，AMDIS）能够将气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）全扫描文件中的色谱图自动去卷积处理，提取出每个成分的“纯净”质谱图和相关信息，并将这些信息与目标谱库进行比较，鉴定报告出匹配因子值大于设定值的色谱峰成分[4]。

常用的风味物质提取方法主要有同时蒸馏萃取[5-6]、加速溶剂萃取[7]、溶剂辅助风味蒸发[8]、固相萃取[9]、固相微萃取[10]、顶空分析（或制样）法[11]、热脱附法[12]、溶剂萃取法[13]，直接蒸馏法[14]等，其中，操作相对容易的是顶空吸附法、溶剂萃取法和直接蒸馏法。顶空吸附法（包括静态顶空和动态顶空[15]）因为操作简便快速，无溶剂，样品用量少等优点，使用广泛[16-19]，但是使用成本较高，特别是样品比较多的情况，并且顶空中成分的相对浓度并不能反⒊样品中的浓度，因为香味物质的挥发性不一样；溶剂萃取法相对容易操作，风味化合物具有良好的回收率，在所有的方法中，定量效果最好，但使用了大量的溶剂，会造成污染，并且萃取物里面可能含有不易挥发的成分，会污染色谱柱；直接蒸馏法操作最容易，产品中不含任何高沸点的组分或非挥发性的成分，不会污染气相色谱（gaschromatography，GC）的进样口和柱子，无溶剂，不会造成污染，但可能有些成分不会出现在萃取物中，或者浓度极低。本研究旨在选择一种成本较低、比较容易操作且不会污染GC进样口和柱子的糟醅预处理方法，因此就水蒸气蒸馏（steam distillation，SD）法、超声辅助溶剂萃取（ultrasonic assisted solvent extraction，UASE）法和蒸馏-微溶剂萃取（steam distillationmicroextraction，SD-MSE）法3种方式进行比较，分析这三种方式的萃取效果，对酒醅中低沸点挥发性成分的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糟醅：出窖粮食糟，取自四川南部某名酒厂；氯化钠（分析纯）、乙醚（色谱纯）：成都市科龙化工试剂厂；实验用水均为超纯水，由本实验室自制。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890B GC/5977MSD气质联用仪、DB-WAX色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；JA5003电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SK-1涡旋混匀器：金坛市医疗仪器厂；AS3120超声波清洗仪：北京华瑞博远科技发展有限公司；RE5299旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；N-EVAPTM111氮吹仪：美国Organomation公司；DL-1电子万用炉：北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糟醅预处理方法

（1）水蒸气蒸馏法

称取25.00 g糟醅，加入50 mL饱和食盐水，常压蒸馏，接取馏出液25 mL，冷藏待测。

（2）超声辅助溶剂萃取法

称取25.00 g糟醅，加入35 mL乙醚，用快速混匀器混匀，超声萃取频率40 kHz，功率120 W，水温20℃，超声萃取时间30 min，过滤，收集滤液将滤渣再用25 mL萃取溶剂萃取两次，合并滤液，用旋转蒸发仪在40℃条件下浓缩到5～10 mL，最后用氮吹仪浓缩至0.5 mL，后用相同的萃取溶剂定容至1 mL，用0.45 μm孔径的滤膜过滤，待测。

（3）蒸馏-微溶剂萃取法

按照（1）中的方法直接水蒸气蒸馏后，取5 mL馏出液于25 mL试管中，加入2 mL萃取溶剂，涡旋混匀器混匀，静置分层，取有机相用0.45 μm孔径的滤膜过滤，待测。

1.3.2 GC-MS分析条件

GC色谱条件：DB-Wax毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气：氦气（He），流速：2 mL/min，不分流；柱温：进样口温度保持在250℃，起始气相色谱柱温在40℃维持3min，之后5℃/min升温至60℃，再以10℃/min升温至230℃，维持8 min，共计32 min。

MS质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电离方式采用电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量：70 eV；扫描质量范围：33～450 m/z；溶剂延迟时间：2.2 min。

定性定量方法：采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11a.L谱库，运用自动质谱退卷积定性系统（AMDIS）分析定性，采用峰面积归一化法定量。

2 结果与分析

与水蒸气蒸馏法和超声辅助溶剂萃取法相比，蒸馏-微溶剂萃取法是先将样品进行水蒸汽蒸馏，然后取少量蒸馏液加入萃取剂利用涡旋辅助萃取，这种方法能够节约大量有机溶剂，避免环境污染，同时又能将蒸馏液中浓度较低的成分进行浓缩，微萃取能减少使用大量溶剂时样品经过多次转移而造成的成分损失，操作时间更短。由3种方法的总离子流色谱图（totalionchromatogram，TIC）见图1。由图1可知，3种方法所得TIC图差异较大，表明这三种方法可能存在明显差异，需要利用质谱信息对化学成分进行进一步比对。

对于某些极性和结构类似的化合物，色谱能够分离的能力有限，因此在TIC色谱图中会出现多种化合物部分或者完全重叠，从而导致不同物质的质谱图相互交错重叠的情况，这时进行谱库检索会造成严重干扰，因而获得的结果往往相似度较低。而应用自动质谱退卷积定性系统（AMDIS）则可以对TIC图自动进行反卷积处理，从相互重叠的质谱图中分离、辨识出单个化合物的质谱信息以及相关色谱保留时间。利用这些单一化合物的质谱信息进行谱库检索就可以筛选出相似度大于设定阀值的化合物，还可以从复杂组分中鉴定出目标化合物，这一能力使其成为质谱重叠峰的成分分析的重要技术手段[20]。本研究利用AMDIS对3种方法提取所得糟醅挥发性成分的TIC图进行辨识，在设定相似度阀值为75%的情况下，从中共鉴定出95种物质，利用面积归一化法计算挥发性成分的相对百分含量，结果见表1。

图1 三种提取方法所得糟醅挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in Zaopei by the three extraction methods

由表1可知，水蒸气蒸馏法测得的挥发性成分共42种（醇类11种，酯类10种，酸类9种，醛酮类4种，酚类6种，其他类2种），其中醇类占69.68%，酯类25.96%，酸类2.37%，其他类0.86%；超声辅助溶剂萃取法共测得的挥发性成分71种（醇类12种，酯类32种，酸类20种，醛酮类2种，酚类4种，其他类1种），其中醇类14.49%，酯类37.42%，酸类39.27%，其他类0.89%；蒸馏-微溶剂萃取法共测得的挥发性成分60种（醇类13种，酯类30种，酸类6种，醛酮类4种，酚类5种，其他类2种）醇类26.16%，酯类64.97%。酸类9.97%，其他类1.12%。经分析，3种方法测得的共有物质有23种，其中，醇类8种，分别是乙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、（2S，3S）-（+）-2,3-丁二醇、（2R，3R）-（-）-2,3-丁二醇以及苯乙醇，酯类物质7种，有乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯；酸类6种，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸；其他类2种，为4-甲基Ⅹ创木酚，2,3-二氢苯并呋喃。

表1 三种提取方法所得糟醅挥发性成分检测结果Table 1 Determination results of the volatile compounds in Zaopei by the three extraction methods

续表

续表

由表1可知，水蒸气蒸馏法、超声辅助溶剂萃取法和蒸馏-微溶剂萃取法3种方法提取检测的物质种类数及相对含量均存在差异，水蒸气蒸馏法检测到的成分种类仅42种，少于后两种方法的71种和60种，其中酯类成分种类数仅10种，远小于超声辅助溶剂萃取法和蒸馏-微溶剂萃取法的32种和30种，表明水蒸气蒸馏法不利于对糟醅中酯类成分的萃取。超声辅助溶剂萃取法比蒸馏-微溶剂萃取法检测到的成分多11种，这11种成分主要是八碳以上的脂肪酸，这些脂肪酸大多沸点较高，无法通过蒸馏的方式从糟醅中馏出。

图2 三种方法提取各类物质相对百分含量比较Fig.2 Comparison of various compounds extraction with the three methods

3种方法各类物质相对百分含量比较结果见图2（醇类物质不包含乙醇）。由图2可知，酒醅中含量较高的成分主要是醇、酸、酯三类成分，超声辅助溶剂萃取法测得的酸类成分相对含量高于其余两种方法，而蒸馏-微溶剂萃取法测得的酯类含量高于其余两种方法。

3 结论

分别采用水蒸气蒸馏（SD）法、超声辅助溶剂萃取（UASE）法和蒸馏-微溶剂萃取（SD-MSE）法从浓香型白酒酒醅中提取挥发性成分，利用峰面积归一化法测定各成分的相对百分含量，通过对挥发性成分的气相色谱-质谱连用/自动化退卷积系统（GC-MS/AMDIS）对比分析。SD鉴定出42种成分，UASE 71种，SD-MSE 60种。 SD测得的醇（不包含乙醇，下同）、酸、酯的相对含量分别为1.34%，6.61%，21.67%；UASE的醇、酸、酯含量分别为1.03%，39.28%，37.42%；SD-MSE 3.96%，9.97%，64.97%。由此可知，SD对酸、酯的提取效果劣于另两种方法，UASE对酸类物质萃取效果更佳，SD-MSE对酯类物质的萃取效果更佳。和UASE相比，SD-MSE节约了大量溶剂，减少了样品转移次数，且待测液澄清透明，是一种适宜萃取糟醅中低沸点成分的方法。

[1]张宿义，许德富.泸型酒技艺大全[M].北京：中国轻工业出版社，2011：10-15.

[2]沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，2007：1-10.

[3]曹云刚.汾酒发酵过程中香味成分变化规律的研究[D].太原：山西大学，2011.

[4]朱保庆，温可睿，王 军，等.利用AMDIS技术解析雷司令果实发育过程中的降异戊二烯类香气物质[J].中外葡萄与葡萄酒，2011（11）：4-9.

[5]张 宁，陈海涛，孙宝国，等.固相微萃取和同时蒸馏萃取方法比较传统腊牛肉的风味成分[J].中国食品学报，2016，16（6）：247-258.

[6]丁芳林，董益生，彭书练.SSD-GC-MS法测定茶叶中的挥发成分[J].中国酿造，2009，28（4）：147-150.

[7]徐敦明，卢声宇，陈达捷，等.加速溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法测定茶叶中10种吡唑和吡咯类农药的残留量[J].色谱，2013，31（3）：218-222.

[8]宫俐莉，李安军，孙金沅，等.溶剂辅助风味蒸发法与顶空-固相微萃取法结合分析白酒酒醅中挥发性风味成分[J].食品与发酵工业，2016，42（9）：169-177.

[9]郑向华，林立毅，方恩华，等.固相萃取-气相色谱-质谱法测定食品中23 种邻苯二甲酸酯[J].色谱，2012，30（1）：27-32.

[10]傅若农.固相微萃取（SPME）近几年的发展[J].分析试验室，2015，34（5）：602-620.

[11]黄惠贞，梁 晖，刘秀彩，等.顶空-气相色谱/质谱联用法测定接装纸中挥发性有机化合物[J].中国烟草学报，2014，20（1）：15-20.

[12]冯丽丽，胡晓芳，于晓娟，等.热脱附-气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定环境空气中的挥发性有机物[J].色谱，2016，34（2）：209-214.

[13]高文俊.青稞酒重要风味成分及其酒醅中香气物质研究[D].无锡：江南大学，2014.

[14]张丽永.直接蒸馏法提取青蒿挥发油的研究[J].科技创新导报，2015，12（1）：38.

[15]唐 静，张迎阳，吴海舟，等.顶空吹扫捕集-气相色谱-质谱法分离鉴定强化高温火腿中的挥发性风味物质[J].食品科学，2014，35（8）：115-120.

[16]SORIA A C,GARCÍA-SARRIÓ M J,SANZ M L.Volatile sampling by headspace techniques[J].Trac Trend Anal Chem,2015,77（6）:85-89.

[17]DING X F,WU C D,HUANG J.Characterization of interphase volatile compoundsinChineseLuzhou-flavorliquorfermentationcellaranalyzed by head space-solid phase micro extraction coupled with gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME/GC/MS）[J].LWT-Food Sci Technol,2016,66（1）:124-133.

[18]曾 游，丁 怡.顶空-毛细管气相色谱法测定葡萄酒中的甲醇[J].现代食品科技，2013，29（2）：405-408.

[19]VANESSA G,MAURIZIO B M,PAOLA M.Volatile fraction analysis by HS-SPME/GC-MS and chemometric modeling for traceability of apples cultivated in the Northeast Italy[J].Food Control,2017,78（2）:215-221.

[20]闫 婕，卫莹芳，古 锐.应用自动质谱退卷积定性系统（AMDIS）和保留指数分析马尔康柴胡地上、地下部分与北柴胡挥发油的成分差异[J].中国中药杂志，2014，39（6）：1048-1053.

A method of extraction of the lower boiling volatile compounds from fermented grains

GUO Jiaxiu1,ZHANG suyi2,3,ZHAO Jinsong1,3,4,WU Weiyu4,SU Zhanyuan4,YANG Jiangang1*
（1.School of Biological Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Luzhou Laojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;3.National Research Center of Solid State Brewing Engineering Technology,Luzhou 646000,China;4.National Quality Supervision and Inspection Center for Alcoholic Products,Luzhou 646000,China）

Steam distillation （SD）,ultrasonic assisted solvent extraction （UASE）and steam distillation-microsolvent extraction （SD-MSE）were used to extract volatile components from fermented grains,and the relative contents of volatile components were determined by peak area normalization method and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry/automated mass spectral deconvolution&identification system （GC-MS/AMDIS）.The results showed that 42,71 and 60 kinds of volatile components were identified by SD,UASE and SD-MSE method,respectively.The relative contents of alcohols,acids and esters were 1.34%,6.61%,21.67%;1.03%,39.28%,37.42%;3.96%,9.97%,64.97%by SD,UASE and SD-MSE method,respectively.It could be concluded that the extraction effect of SD method on acids and esters was inferior to the other two methods,UASE method had better extraction effect on acids,and SD-MSE method had better extraction effect on esters.Compared with UASE method,SD-MSE could save a large amount of solvent,reduce the number of times for samples transfer,and the sample was clear and transparent,which was a kind of method suitable for extraction of low boiling volatile components in fermented grains.

steam distillation method;ultrasonic assisted solvent extraction method;steam distillation-microextraction method;gas chromatographymass spectrometry/automated mass spectral deconvolution&identification system

TQ920.6

0254-5071（2017）12-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.030

2017-09-03

酿酒生物技术及应用四川省重点实验室（NJ201501）；固态酿造研究院士（专家）工作站开放基金（GY2015-03）；四川省省属高校科研创新团队建设计划（16TD026）

郭家秀（1992-），硕士研究生，研究方向为酿酒生物技术及应用。

*通讯作者：杨建刚（1961-），教授，博士，研究方向为食品发酵与酿造技术。