锁掷酵母破壁技术的研究

吕天琪，杜 超，曹小彦，王海鸣，钱 和*

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.广州广电计量检测股份有限公司，广东 广州 510000）

锁掷酵母破壁技术的研究

吕天琪1，杜 超1，曹小彦2，王海鸣2，钱 和1*

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.广州广电计量检测股份有限公司，广东 广州 510000）

分析比较了酸热法、二甲基亚砜法、细胞自溶法、高压均质法及酶促法对锁掷酵母的破壁效果，及对类胡萝卜素提取率的影响。结果表明，与其他4种破壁方法相比，高压均质法具有破壁效果好（破壁率达72.4%）、类胡萝卜素提取率高（67.3%）、破壁时间短、工艺简单、安全无污染等优点。通过均质压力、均质次数和菌液浓度这3个因素对高压均质法进行工艺优化，发现均质压力80 MPa、均质3次、菌液浓度为8%时，细胞破壁及类胡萝卜素提取效果最佳，分别是78.3%和82.5%。该研究结果为锁掷酵母的开发利用及类胡萝卜素的提取提供了理论依据及技术支持。

锁掷酵母；细胞破壁；高压均质；工艺优化

类胡萝卜素具有预防癌症和心血管疾病等多种生理功能，目前已广泛应用于食品、化妆品、医药和水产养殖业中[1-2]。动物体内无法合成类胡萝卜素，必须通过食物来摄入，植物中的类胡萝卜素含量低，难以大规模生产，而化学合成的类胡萝卜素生物活性较低[3]。酵母培养时间较短、异氧代谢快速且易于实现高密度培养，因而利用酵母工业化生产天然类胡萝卜素一直是国内外研究的热点，有广泛的实用价值和开发前景[4]。当前，锁掷酵母属（Sporidiololus）、红酵母属（Rhodotorula）、法夫酵母属（Phaffia）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）和三孢布拉霉（blakeslea trispora）等是生产天然类胡萝卜素的主要菌种[5-8]。

但是类胡萝卜素是锁掷酵母的胞内产物，破壁后才能被加以利用，所以破壁效果直接影响到锁掷酵母生产类胡萝卜素的产量和质量[9]。酵母细胞除了含类胡萝卜素外，还含有丰富的人体必需氨基酸、B族维生素、不饱和脂肪酸等营养物质[10]。因此，为充分利用酵母细胞内丰富的营养资源，研究锁掷酵母的高效破壁方法尤为重要，具有重要的现实意义。目前已被应用于酵母破壁的方法有物理[11]、化学[12]及生物破壁[13-16]等方法。本研究以一株自行分离的锁掷酵母为试验材料，比较酸热法、二甲亚砜法、细胞自溶法、高压均质法及酶促法的破壁效果，选择一种工艺简单、安全卫生、破壁效果好、类胡萝卜素保留率高的破壁方法，并对其工艺进行优化，以期为将来高效利用锁掷酵母提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2-8：由本实验室筛选而得；浓盐酸、二甲亚砜、氯化钠、丙酮（分析纯）：国药上海化学试剂有限公司；碱性蛋白酶：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

JHG-Q54-P100高压均质机：上海普丽盛融合机械设备有限公司；XSP-2C生物光学显微镜：苏州欧卡精密光学仪器有限公司；XB-K-25血细胞计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司；AB204-N电子天平：Mettler-Toledo Group；centrifugae5804R离心机：德国Eppendorf AG；ZNCL-GS智能磁力搅拌器：郑州科华仪器设备有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；WFJ7200可见分光光度计：龙尼柯上海仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

酸热法：取发酵液10 mL，8 000 r/min离心10 min，收集菌泥，用去离子水清洗2～3遍，加入等体积的3 mol/L盐酸室温浸泡1 h，沸水浴加热3 min，迅速进行冰浴，冷却后离心（4 000 r/min、5 min），洗涤沉淀2次，加入足量丙酮振荡萃取20 min，得类胡萝卜素浸提液。

二甲亚砜法：取发酵液10 mL，8 000 r/min离心10 min；弃上清，加入30 mL预热至55℃的二甲基亚砜，在磁力搅拌器上55℃搅拌5 h；4 000 r/min离心10 min，洗涤沉淀2次，加足量丙酮振荡萃取20 min，得类胡萝卜素浸提液。

细胞自溶法：在50 mL发酵液中加入4 g无菌NaCl，40℃、100r/min摇床中自溶72 h；取10 mL自溶后的发酵液，4 000 r/min离心10 min，洗涤沉淀2次，用足量丙酮振荡萃取20 min，得类胡萝卜素浸提液。

高压均质法：发酵液在60 MPa的压力下，连续高压均质3次，均质流速为250 mL/min；取10 mL高压均质后的发酵液，4000r/min离心10min，洗涤沉淀2次后加入足量丙酮振荡萃取相同时间（20 min），得类胡萝卜素浸提液。

酶促法：在发酵液中，按4 mg/g酵母干质量的添加量加入碱性蛋白酶，用NaOH溶液将pH值调至10.0；于37℃酶解9 h，煮沸5 min灭酶活，取10 mL酶解后的发酵液，4 000 r/min离心10 min，洗涤沉淀后加足量丙酮振荡萃取20 min，得类胡萝卜素浸提液。

1.3.2 工艺优化试验方案

以锁掷酵母细胞破壁率及类胡萝卜素提取率为评价指标，选取菌液浓度、均质压力和均质次数为评价因素，优化高压均质法的工艺条件。首先考察单个因素的影响，找到3个因素的影响规律及优化范围。随后根据单因素试验结果，进一步采用3因素3水平正交试验对均质条件进行优化。正交试验的因素水平见表1。

表1 锁掷酵母破壁工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

1.3.3 测定方法

酵母破壁率：破壁前锁掷酵母菌液取样稀释，在生物学显微镜下观察血球计数板上所有酵母细胞个数C。不同方法破壁后，取样稀释后在显微镜下观察血球计数板上未破壁的酵母细胞个数C’[17]。采用XB-K-25血球计数板，每个样品重复计数3次，每次数值差距不应相差过大，取平均值。破壁率计算公式：

式中：B为破壁率，%；C为破壁前的酵母细胞数（相同稀释倍

数）；C’为破壁后未破壁的酵母细胞数（相同稀释倍数）。

类胡萝卜素提取率：取不同方法破壁后丙酮萃取得到的类胡萝卜素浸提液，稀释相同倍数后，测定吸光度值，总类胡萝卜素含量计算公式如下：

式中：W为总类胡萝卜素含量，μg/g干质量；A为波长475 nm处的吸光度值；m为细胞干质量，g；D为稀释倍数；V为提取类胡萝卜素丙酮总体积，mL；0.16为类胡萝卜素的消光系数。

用珠磨法[18]将离心后的酵母细胞完全破壁，测得破壁前的总类胡萝卜素含量。

2 结果与分析

2.1 不同酵母破壁方法比较

2.1.1 不同酵母破壁方法破壁率的比较

图1 不同破壁方法对破壁率的影响Fig.1 Effects of different methods on wall breaking rate

由图1可知，酸热法的破壁效果最佳，破壁率约为99.9%，说明酵母细胞壁破碎完全。高压均质法和二甲基亚砜法次之，破壁率分别为72.4%和51.6%，但是二甲基亚砜破壁需5 h，消耗时间过长。酶促法破壁率较低，为19.5%，可能是仅使用了蛋白酶，没有破坏细胞壁外层的葡聚糖和甘露聚糖网状结构，导致效果不佳。细胞自溶法的破壁率最低，仅为1.3%，表明酵母细胞壁几乎没有破碎。

2.1.2 不同酵母破壁方法类胡萝卜素提取率的比较

图2 不同破壁方法对类胡萝卜素提取率的影响Fig．2 Effects of different methods on carotenoid extraction rate

不同破壁方法对类胡萝卜素提取率的影响见图2。由图2可知，高压均质法破壁后类胡萝卜素提取率最高，达到67.3%，说明细胞壁破碎较完全，类胡萝卜素损失较少；二甲亚砜法效果次之，类胡萝卜素提取率为50.1%，推测是由于破壁时间过长，类胡萝卜素被氧化损失；酸热法的类胡萝卜素提取率仅为52.3%，推测高温使类胡萝卜素发生了氧化反应，在加热过程中造成大量的损失。此外，在试验条件下，细胞自溶法破壁后，没有提取到类胡萝卜素。

综合上述试验结果发现，酸热法破壁虽高，但高温容易使类胡萝卜素发生氧化反应，在破壁过程中造成过多的类胡萝卜素损失，导致类胡萝卜素提取率较低。二甲基亚砜法消耗时间较长，在此过程中类胡萝卜素已被氧化，且二甲基亚砜沸点较高难回收，不能用于食品中，故此法只能用于试验室研究，无法应用于工业化生产。用酶促法破壁时，存在产物抑制的问题，导致胞内物质释放率降低，同时酶法破壁相对成本较高，试验结果也不理想。锁掷酵母细胞壁过厚，细胞自溶法不适用于锁掷酵母的破壁。而高压均质法破壁效果好、类胡萝卜素提取率高，且操作简单、耗时短，类胡萝卜素损失较少，不会造成有机溶剂的污染，是锁掷酵母细胞破壁最理想的方法。

2.2 高压均质法工艺优化单因素试验

根据工业化要求和设备的限制，均质压力不宜过大，均质次数不宜太多，物料浓度不宜过高，故均质压力取40～100 MPa，均质次数取1～6次，菌液浓度取1%～10%进行单因素试验，结果见图3。

由图3可知，随着均质压力的增大，酵母破壁类胡萝卜素提取率先升高后降低，在均质压力为80 MPa时达到最大，因此选择均质压力70 MPa、80 MPa、90 MPa进行后续试验；随着均质次数的增加，类胡萝卜素提取率先升高后降低，均质次数为3次时，类胡萝卜素提取率最高，破壁率持续升高，但超过3次后破壁率增长趋势平缓，说明再增加均质次数对破壁率的影响很小，而且还会造成类胡萝卜素的损失，故选择优化范围取2次、3次、4次；随着酵母菌液浓度的增大，酵母细胞的破壁率先增加后减小，在6%浓度时破壁率最大，类胡萝卜素提取率持续升高，但菌液浓度超过6%后，类胡萝卜素提取率增长缓慢，故选择优化范围为4%、6%、8%。

图3 均质压力（A）、均质次数（B）、菌液浓度（C）对破壁率和类胡萝卜素提取率的影响Fig．3 Effect of homogenization pressure （A），times （B）and bacteria concentration （C）on wall breaking rate and carotenoid extraction

2.3 正交优化试验

在单因素试验的基础上，考察均质压力、均质次数、菌液浓度对酵母细胞破壁率及类胡萝卜素提取率的影响，结果见表2，方差分析见表3和表4。

由表2～表4可知，影响酵母细胞破壁率的因素主次为均质压力＞均质次数＞菌液浓度，最佳工艺参数组合为A3B3C3，即均质压力为90 MPa、均质次数4次、菌液浓度为8%的工艺条件，在此条件下进行验证试验得到酵母细胞破壁率为88.5%，类胡萝卜素提取率为65.3%。在置信度为95%条件下，均质压力、均质次数对酵母细胞破壁率的影响达到显著效果，而菌液浓度无显著性。影响酵母细胞破壁后类胡萝卜素提取率的因素主次为均质压力＞菌液浓度＞均质次数，最佳的工艺参数组合为A2B2C3，即均质压力为80 MPa、均质次数为3次、菌液浓度为8%，在此条件下得到酵母细胞破壁率为78.3%，类胡萝卜素提取率为82.5%。在置信度为95%条件下，3个因素对类胡萝卜素提取率的影响均达到显著效果。鉴于实际生产中主要注重于类胡萝卜素的提取率，故选择A2B2C3为最佳工艺参数，即均质压力为80MPa、均质次数为3次、菌液浓度为8%。

表2 锁掷酵母进行破壁工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

表3 以破壁率为评价指标的正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments using wall breaking rate as evaluation index

表4 以类胡萝卜素提取率为评价指标的正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments using carotenoid extraction rate as evaluation index

3 结论

锁掷酵母细胞壁比一般红酵母更厚，更坚实，目前常用于红酵母破壁的方法难以将锁掷酵母破壁，而且当前对锁掷酵母破壁方法的研究鲜有报道。为更好地利用锁掷酵母的发酵产物，本试验以酵母细胞破壁率和类胡萝卜素提取率为考察指标，对锁掷酵母破壁工艺进行研究，比较几种破壁方法后发现高压均质法破壁率高，类胡萝卜素提取率高，破壁时间短，工艺简单并且安全无污染，是最适合大规模地从锁掷酵母中提取类胡萝卜素的破壁方法。并且确定了最佳工艺条件：菌液浓度8%、均质压力80 MPa、均质次数3次，在此条件下锁掷酵母破壁率和类胡萝卜素提取率分别达到了78.3%和82.5%，为锁掷酵母发酵产物的后续研究提供了技术支撑，对锁掷酵母工业化生产天然类胡萝卜素具有指导意义。

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Breaking technology ofSporidiobolus pararoseuscell wall

LYU Tianqi1,DU Chao1,CAO Xiaoyan2,WANG Haiming2,QIAN He1*
（1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Guangzhou Grg Metrology&Test Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China）

Sporidiobolus pararoseuswas broken by five different technologies:acid heat method,dimethyl sulfoxide method,cell autolysis method,high pressure homogenization method and enzymatic method.The effect of different methods on cell-breaking and carotenoid extraction rate was analyzed and compared.Results showed that among the five breaking methods,the high pressure homogenization method had advantages of better breaking effect（wall breaking rate of 72.4%）,higher carotenoid extraction rate （67.3%）,short-time,simple process,safe and pollution-free and so on.The factors of homogenization pressure,homogenization times and microbial concentration of high pressure homogenization method were optimized,and results showed under the conditions of homogenization pressure 80 MPa,times 3 and bacterial concentration 8%,the cell wall breaking rate and the carotenoid extraction rate were 78.3%and 82.5%,respectively.The study provided theoretical basis and technical support for the development and utilization ofS.pararoseusand the extraction of carotenoids.

Sporidiobolus pararoseus;cell wall breaking;high homogenization;process optimization

TS201.1

0254-5071（2017）12-0088-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.018

2017-10-09

吕天琪（1994-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。

*通讯作者：钱 和（1962-），女，教授，博士，研究方向为食品安全与质量控制。