3种常见中药材中绿原酸类成分提取的“逆溶解度”现象△

陈乐，郭璐娟，康利平，朱芸芸，陈昌婕，于金倩，杜鸿志，*，刘大会*

1.湖北中医药大学 中药资源中心，湖北 武汉 430065；2.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；3.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省分析测试中心，山东 济南 250014

中药化学成分复杂多样，其成分的复杂性构成了功效的多样性[1]。根据中药中各种化学成分在溶剂中的溶解性质选择合适的提取溶剂，可显著提高中药中有效成分的提取率。中药提取主要遵循“相似相溶”原理，即选择和溶质极性相近的溶剂进行提取[2]，这对中药配方颗粒的制备、植物化学成分的分离等具有重要意义。绿原酸类成分是咖啡酸与天然奎宁酸的结合物，存在于多种高等植物中[3]。近年来，人们对绿原酸类化合物的关注日益增加，原因除了其具有酚酸、黄酮等酚类化合物常见的生物活性（抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤作用）及相对较低的不良反应外[4-6]，绿原酸类化合物还被证实能降低血糖、治疗轻度高血压和降低胆固醇水平等[7-8]。因此，随着关于绿原酸类成分研究的逐年增多，有必要对中药中绿原酸类成分在不同溶剂中的溶解性、提取过程中含量变化规律等展开研究，以探寻中药中各绿原酸类成分的最佳提取条件。

菊科蒿属植物艾叶Artemisia argyiLevl.et Vant.、菊科菊属植物菊花Chrysanthemum morifoliumRamat.及忍冬科忍冬属植物金银花Lonicera japonicaThunb.均是中国传统大宗常用中药材。近年来，在医疗保健、养生美容及动物饲料等相关领域备受青睐，是目前绿原酸类化合物的重要来源[3,9-10]。本课题组在前期实验中发现，艾叶提取过程中存在“逆溶解度”现象（即中药材中绿原酸类化合物在某种溶剂中的提取率与其在该溶剂中的溶解性能相反的现象）。例如，艾叶中绿原酸类成分咖啡酸溶解性质为微溶于冷水，易溶于乙醇，而艾叶在超声提取时咖啡酸在纯水中的提取率却显著高于乙醇，与自身溶解特性相反。在此基础上，本研究系统测定了艾叶、菊花和金银花3 种中药材中主要绿原酸类成分在纯水、乙醇的溶解度，并利用超声辅助提取法和加热回流提取法比较了3 种中药材中绿原酸类成分在水和乙醇中提取率的差异，揭示了中药在不同科属、不同提取条件下的“逆溶解度”现象，同时探究了各绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律，以期为绿原酸类成分的提取分离、中药配方颗粒制备工艺的优化及深入挖掘应用价值提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；PS-40 型超声波清洗器（深圳超艺达科技有限公司）；ZNHW 型智能恒温电热套（天津工兴实验室仪器有限公司）；EX125DZH 型十万分之一电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；WP-UPGX 型超纯水机（上海研承仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品新绿原酸（5-CQA，批号：DSTDX001501）、绿原酸（3-CQA，批号：DST200822-021）、咖啡酸（CA，批号：DST191030-013）、隐绿原酸（4-CQA，批号：DSTDY003501）购于德斯特生物科技有限公司；对 照 品 异 绿 原 酸B（3,4-diCQA，批 号：Y06911812012）、异绿原酸A（3,5-diCQA，批号：Y06801911011）和异绿原酸C（4,5-diCQA，批号：Y07011805016）购于成都瑞芬思生物科技有限公司，所有对照品纯度均＞98%；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；无水乙醇、甲酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 份金银花样品、4 份艾叶样品和4 份菊花样品均于2020 年采摘，保存于湖北中医药大学中药资源中心，由湖北中医药大学刘大会教授鉴定均为正品。样品信息见表1。

表1 金银花、艾叶、菊花样品信息

2 方法

2.1 超高效液相色谱法（UHPLC）条件

参照文献[11]的UHPLC 色谱条件对艾叶、菊花和金银花样品中主要绿原酸类成分的含量进行测定，以0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）进行梯度洗脱（0～0.3 min，2%～5%B；0.3～1.0 min，5%B；1.0～7.0 min，5%～20%B；7.0～9.0 min，20%B；9.0～9.5 min，20%～25%B；9.5～12.5 min，25%～28%B；12.5～18.0 min，28%～40%B；18.0～18.3 min，40%～80%B；18.3～21.0 min，80%～98%B；21.0～24.0 min，98%B）；流速为0.5 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为1 μL；检测波长为330 nm。对该法进行仪器精密度、方法重复性、稳定性及加样回收率方法学考察。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取7个对照品适量，用甲醇溶解、定容，制得5-CQA、3-CQA、CA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA 质量浓度分别为7.37、12.71、29.11、3.73、315.56、545.00、358.33 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.3 绿原酸类成分的溶解度测定

称取各对照品适量，分别以纯水和乙醇为溶剂，置室温下充分振摇后超声60 min，使其达到溶解平衡状态，稀释一定倍数后按2.1项下条件进行测定，分别测定7个绿原酸类成分在2种溶剂中的溶解浓度。

2.4 不同提取方法下绿原酸类成分在2 种溶剂中提取率的测定

2.4.1 超声辅助提取法 将3 种中药材粉碎，过一号筛，精密称取各样品粉末0.1 g 于20 mL 量瓶中，分别加入纯水、乙醇定容至刻度线，称定质量，放置过夜，超声60 min，冷却至室温后用相应溶剂补足减失质量，静置，经0.22 μm 微孔滤膜滤过后按2.1项下条件进行测定。

2.4.2 加热回流提取法 精密称取各样品粉末5.0 g 于2000 mL 三颈烧瓶中，分别加入纯水、乙醇1000 mL，称定质量，放置过夜，置电热套中回流提取60 min，冷却至室温后用相应溶剂补足减失质量，静置，经0.22 μm 微孔滤膜滤过后按2.1 项下条件进行测定。

2.5 绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律

精密称取各样品粉末0.1 g 于20 mL 量瓶中，分别加入不同体积分数乙醇（0、25%、50%、75%、100%）定容至刻度，称定质量，放置过夜，超声60 min，冷却至室温后用相应体积分数的乙醇补足减失质量，静置，经0.22 μm微孔滤膜滤过后按2.1项下条件进行测定。各对照品及样品色谱图见图1。

图1 混合对照品及样品在水溶液中超声提取时的UHPLC图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取2.2 项下混合对照品溶液适量，稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液，分别按2.1 项下条件测定，以各对照品的质量浓度为横坐标（X）、相应的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，见表2。

表2 7个绿原酸类成分的线性关系

2.6.2 精密度试验 分别取同一份混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次，结果5-CQA、3-CQA、CA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA峰面积的RSD分别为1.20%、1.27%、0.83%、1.15%、0.92%、1.05%、1.07%，说明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 称取同一批粉末样品，分别按2.4.1 和2.4.2 项下方法制备的样品，于0、2、4、8、12、16、24、48 h进样，按2.1项下色谱条件进样分析，计算样品中7 个对照品色谱峰峰面积的RSD，超声辅助提取时峰面积的RSD 分别为1.2%、1.1%、1.3%、1.2%、1.2%、1.1%、1.4%，加热回流提取时峰面积的RSD 分别为1.3%、1.2%、1.4%、1.2%、1.5%、1.3%、1.4%，说明样品在48 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 称取同一批粉末样品0.1 g，平行6 份，分别按2.4.1 和2.4.2 项下方法制备样品后按2.1项下色谱条件进样分析，计算样品中7个绿原酸类成分含量的RSD，超声辅助提取时含量的RSD 分别为1.4%、2.1%、1.7%、1.5%、1.5%、1.2%、1.3%，加热回流提取时含量的RSD 分别为1.6%、1.4%、1.2%、1.5%、1.2%、1.4%、1.2%。

2.6.5 加样回收率试验 精密称定已知含量的同一批粉末样品0.1 g，平行9份，分别按1.0∶0.8、1∶1、1.0∶1.2 依次精密加入单一对照品溶液，每个比例3 份，然后按2.4.1 和2.4.2 项下方法制备样品后按2.1项下色谱条件进样分析，计算各对照品的加样回收率。7个对照品溶液的在超声辅助提取时加样回收率分别为96.9%、97.3%、102.5%、100.4%、98.6%、99.2%、101.3%，对应的RSD 分别为1.6%、2.2%、1.8%、0.9%、2.1%、1.1%、1.6%；在加热回流提取时加样回收率分别为98.2%、97.8%、100.3%、101.4%、99.2%、98.6%、98.4%，对应的RSD 分别为1.7%、1.4%、1.8%、1.9%、1.3%、2.0%、1.5%。

2.7 数据分析

利用Excel 2010和SPSS 23.0对数据进行统计分析，结果采用（）表示。采用t检验比较两组间显著性。运用GraphPad 8.0 和Origin 2019 进行作图分析。

3 结果与分析

3.1 7个绿原酸类成分在水和乙醇中的溶解度差异

本研究测定了7 个绿原酸类化合物在纯水、乙醇2 种常见溶剂中的溶解度（表3）。结果表明，除4-CQA 在2种溶剂中均有较好的溶解性外（溶解度＞150 mg·mL-1），其余6 个绿原酸类成分经充分振摇并超声60 min 后，在水中能较快达到饱和状态，在乙醇中溶解度更大。以CA 为例，纯水中溶解度仅为0.28 mg·mL-1，而在乙醇中溶解度高达52.99 mg·mL-1，与ChemSpider 数 据 库（http://www.chemspider.com/）收载的CA 在乙醇中的溶解度（50 mg·mL-1）基本吻合；3-CQA、3,4-diCQA 和3,5-diCQA在乙醇中即使溶解度接近200 mg·mL-1时，也并未达到溶解平衡，但其在乙醇中的溶解度远大于纯水。7 个绿原酸类成分在乙醇中溶解度是纯水中的数十倍甚至数百倍，这和数据库中列出的溶解性一致，表明乙醇与其自身的极性更为接近。

表3 7个绿原酸类成分在水和乙醇中的溶解度比较 mg·mL-1

3.2 水和乙醇2 种溶剂超声提取3 种中药材中绿原酸类成分含量的比较

以纯水和乙醇为提取溶剂，利用现代超声辅助提取法分别提取艾叶、菊花和金银花中的主要绿原酸类成分，比较3种中药材中绿原酸类成分在2种溶剂中提取含量的差异。结果表明，3种中药材不同来源样品提取含量变化趋势一致，但不同植物间各绿原酸类成分在2种提取溶剂中含量变化趋势有明显差异。在菊花、金银花样品中均未检测到CA（图2）。艾叶和菊花样品中各绿原酸类成分均表现为在乙醇中的提取含量低于纯水，且2 种植物中5-CQA、3-CQA、CA 和4-CQA 在乙醇中的提取含量接近于0；菊花样品中3,4-diCQA 在乙醇中的提取含量也接近于0。这与绿原酸类成分对照品在2 种溶剂中的溶解性完全相反，不符合“相似相溶”原理。与菊科植物不同的是，忍冬科植物金银花样品中5-CQA、3-CQA 和4-CQA 在乙醇中的提取含量仅略低于纯水，差异无统计学意义；而3,4-diCQA、绿原酸A、绿原酸C 的提取含量表现为在乙醇中显著高于纯水，说明金银花在超声提取过程中仅部分绿原酸类成分存在“逆溶解度”现象。上述结果表明，中药材在超声提取过程中存在“逆溶解度”现象，而不同植物间“逆溶解度”现象强弱不同，这为今后中药材中绿原酸类成分的提取提供新的思路。

图2 纯水和纯乙醇超声提取艾叶、菊花、金银花药材中绿原酸类成分质量分数的差异（, n=3）

3.3 水和乙醇2 种溶剂加热回流提取3 种中药材中绿原酸类成分含量的比较

采用加热回流提取法进一步比较了3 种中药材在纯水、乙醇2 种溶剂中的提取含量差异，结果见图3。在菊花、金银花加热回流提取样品中也未检测到CA，不同来源样品提取规律一致，而菊科植物中各绿原酸类成分在2种溶剂中的提取规律与金银花有显著差异。菊科植物在加热回流时中除3,5-diCQA在乙醇中的提取含量显著（P＜0.05，P＜0.01）高于纯水外，其余绿原酸类成分在乙醇中的提取率均显著低于纯水，与超声辅助提取样品中提取规律基本一致，也存在显著的“逆溶解度”现象。然而，忍冬科植物金银花在加热回流提取中，3-CQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA 在乙醇中的提取含量表现为显著高于纯水，呈现“逆溶解度”现象的绿原酸类成分包括5-CQA、4-CQA和3,4-diCQA。该结果表明中药材在加热回流提取过程中也存在“逆溶解度”现象，同样以艾叶、菊花更为显著。

图3 纯水和纯乙醇加热回流提取艾叶、菊花、金银花药材中绿原酸类成分质量分数的差异（, n=3）

3.4 金银花中绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律比较

对金银花中5-CQA、3-CQA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA 及4,5-diCQA 6 个绿原酸类成分在不同体积分数乙醇（0、25%、50%、75%、100%）中的提取含量进行分析，结果见图4。金银花样品中6个绿原酸类成分都是随乙醇体积分数的升高呈现先增高后降低的趋势，均在乙醇体积分数为50%时有最高的提取率。根据“相似相溶”原理，50%体积分数乙醇的极性与金银花样品中6 个绿原酸类成分的极性相当。该结果与先前的报道基本一致[12]，当乙醇体积分数＞50%后，醇溶性成分溶出增加，影响了酚酸类物质的提取。

图4 不同体积分数乙醇提取金银花样品中绿原酸类成分的提取规律（, n=3）

3.5 艾叶中绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律比较

以不同体积分数乙醇提取4份不同产地艾叶样品中绿原酸类成分，共检测到新绿原酸、3-CQA、CA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA 7 个绿原酸类成分。结果显示，不同艾叶样品中7个绿原酸类成分含量随乙醇体积分数变化规律一致（图5），即随着乙醇体积分数的升高，3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的含量呈现先升高后降低的趋势，在乙醇体积分数为50%时提取含量最高，与金银花变化趋势相同；而5-CQA、3-CQA、CA和4-CQA的含量则是随着乙醇体积分数的升高而逐渐减少，在纯水中的提取含量最高，呈现显著的“逆溶解度”现象。结合金银花样品在不同体积分数乙醇中的提取规律，说明绿原酸类成分在不同植物中提取规律有显著差异。因此，在中药材提取过程中应先探索目标成分在不同溶剂中的提取率以确保较高的得率。

图5 不同体积分数乙醇提取艾叶样品中绿原酸类成分的提取规律（, n=3）

3.6 菊花中绿原酸类成分在不同体积分数乙醇中的提取规律比较

在4份不同来源菊花样品中检测到5-CQA、3-CQA、4-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA 6 个绿原酸类成分，未检测到CA。不同菊花样品中绿原酸类成分含量在不同体积分数乙醇中变化规律保持一致（图6）。菊花在提取过程中虽“逆溶解度”现象明显，但不同于艾叶的是，菊花样品中随乙醇体积分数的升高含量逐渐降低的是5-CQA、4-CQA和3,4-diCQA，3个绿原酸类成分在水中含量最高；而含量呈现先增高后降低的成分包括3-CQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA，在50%体积分数乙醇下提取含量最高。上述结果表明，中药材提取过程中绿原酸类成分的提取规律即使在同科不同属种植物间也呈现显著差异。

图6 不同体积分数乙醇提取菊花样品中绿原酸类成分的提取规律（, n=3）

4 讨论

中药材中化学成分多样、关系复杂，探究其有效成分在不同条件下的提取规律及相互作用，对优化提取工艺及深入挖掘应用价值具有重要意义[13-14]。本研究基于UHPLC，测定了7 个绿原酸类成分在纯水、乙醇中的溶解性能，发现几种绿原酸类成分在乙醇中的溶解度是纯水中的数倍甚至数十倍、数百倍，基本符合其微溶于冷水、易溶于乙醇的性质。而在对菊科植物艾叶、菊花和忍冬科植物金银花3种常见大宗中药材进行绿原酸类成分提取过程中发现，2 种菊科植物中绿原酸类成分在超声提取时乙醇的提取含量显著低于纯水，与各成分单体溶解度完全相反；加热回流提取时除3,5-diCQA 外，其余绿原酸类成分呈现相同的现象。忍冬科植物金银花在提取时也有部分绿原酸类成分呈现该现象，超声提取时5-CQA、3-CQA 和4-CQA 在乙醇中的提取率略低于纯水；加热回流提取时5-CQA、4-CQA 及3,4-diCQA 在乙醇中含量显著低于纯水。说明该现象在中药材提取过程中普遍存在，但可能因中药种类、提取方法而异，如不同溶剂对不同植物组织细胞破坏程度不同，进而影响成分的提取率。因此，今后在中药材绿原酸类成分的提取过程中应将“逆溶解度”现象考虑在内，从而选择合适的提取条件及提取溶剂以获得更高的提取率。

为进一步揭示中药中绿原酸类成分提取中的“逆溶解度”现象，本研究以超声提取探究了3 种中药材中绿原酸类成分在不同体积分数乙醇（0、25%、50%、75%、100%）中提取规律。结果显示，金银花中检测到的6 个绿原酸类成分的含量随乙醇体积分数的增大先增大后减小，并且均在乙醇体积分数为50%时达到最高值。当乙醇体积分数＞50%，各绿原酸类成分提取含量逐渐降低，从而呈现出“逆溶解度”现象，推测可能是植物中醇溶性杂质、色素等亲脂性强的成分过多阻碍了绿原酸类成分的溶出[15]。这与一些盐类在水等溶剂中的溶解度随着温度的升高而增加，当温度超过某一数值后，其溶解度随着温度的增加反而下降的“逆溶解度”特性相似。然而，在艾叶和菊花中却表现出更为显著的“逆溶解度”现象。艾叶中3 个异绿原酸成分变化趋势与金银花一致，但5-CQA、3-CQA、CA和4-CQA却在纯水中呈现最高的提取率，并随着乙醇体积分数的升高而降低。菊花与艾叶略有不同的是，绿原酸含量变化趋势与金银花相同，而3,4-diCQA 在纯水中提取的含量最高。

目前，呈现出上述提取规律公认的原因主要是成分溶解率受提取过程中溶剂对细胞的渗透性能、药材中各组分相互影响与共溶、分子在细胞内存在状态等影响。然而，本研究认为，植物中不同绿原酸类成分间可能还存在某种特异的结合方式，且在不同植物间也略有差异。有研究表明，中药复方水煎过程中有效成分可产生相互作用，肉桂酸和黄连素自组装形成超分子聚合物，从而明显增强对临床多重耐药金黄色葡萄球菌的抑制作用[16]。由相同或不同种类的单体通过非共价键自组装形成的超分子聚合物，基于非共价键的可逆性可区别于单体，从而显示出独特的特性[17]。利用中药化学成分的分子识别与自组装特性，总结出各类成分提取规律，开发新的提取、分离方法，不仅能兼顾中药的多成分群，更能提高中药提取分离的特异性、准确性、稳定性[18]。然而，“逆溶解度”现象中存在的相互作用还需进一步深入研究其内在机制才能给出合理的解释。

综上所述，本研究揭示了中药材中绿原酸类成分在不同植物、不同提取方法、不同提取溶剂中存在强弱不一的“逆溶解度”现象，为绿原酸类成分的提取和深入研究提供了新的思路，对中药配方颗粒制备工艺优化、植物化学分离条件优选及工业生产有重要的指导意义。