糖皮质激素对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞及肥大细胞浸润及P物质含量的影响

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(1.南华大学附属南华医院耳鼻咽喉头颈外科，湖南 衡阳 421001；2.娄底市中心医院耳鼻咽喉头颈外科)

·基础医学·

糖皮质激素对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞及肥大细胞浸润及P物质含量的影响

陈祖尧1，罗志葵2，朱发梅1，郑家法1

(1.南华大学附属南华医院耳鼻咽喉头颈外科，湖南 衡阳 421001；2.娄底市中心医院耳鼻咽喉头颈外科)

目的探索糖皮质激素对变应性鼻炎(AR)豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润、肥大细胞浸润及P物质(SP)含量的影响。方法30只雄性豚鼠分为正常组(对照组)、变应性鼻炎组(模型组)和糖皮质激素治疗组(干预组)(n=10)。采用卵清蛋白腹腔注射基础致敏及双侧鼻腔局部激发建造豚鼠变应性鼻炎模型，干预组用糖皮质激素布地奈德喷鼻治疗。对照组及模型组同期用生理盐水喷鼻处理。豚鼠鼻中隔黏膜予以苏木素—伊红染色、甲苯胺蓝染色及SP免疫组化分析,显微镜下观察计数鼻中隔黏膜中嗜酸粒细胞和肥大细胞浸润程度。光密度半定量分析SP免疫组化染色。结果与对照组比较，模型组症状学评分满足变应性鼻炎诊断标准，有明显嗜酸性粒细胞及肥大细胞浸润；与模型组比较，糖皮质差异激素喷鼻治疗干预后，干预组各项指标和症状均有改善。结论局部应用布地奈德有缓解AR症状，并能降低嗜酸性粒细胞及肥大细胞的浸润程度，减轻组织炎性反应，可能是与通过抑制变应性鼻炎鼻黏膜中SP释放有关。

变应性鼻炎； 嗜酸性粒细胞； 肥大细胞； P物质

变应性鼻炎 ( allergic rhinitis，AR)俗称过敏性鼻炎，是机体通过各种途径接触(主要是呼吸道)个体化的变应原后，鼻腔鼻窦黏膜产生的IgE 介导的非病原微生物感染性炎症，目前认为，Th1/Th2稳态因受变应原的影响所产生的失衡构成了AR的免疫学基础。变应性鼻炎的发生、发展是由于变应原激活嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞及树突状细胞等多种炎性细胞,在这些细胞内中经过多种配体受体信号传导途径后激活相关因子如NF-κB等，继之释放白细胞介素、组胺、白三烯等多种细胞因子及炎症递质[1]。目前研究表明鼻黏膜感觉神经纤维末梢受到轴索反射的作用而被激活释放多种神经肽,这些神经肽如SP、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽等在介导的局部血管通透性增加、炎性细胞浸润以及组织损伤中起重要作用[2]。本实验采用卵清蛋白致敏方法制备AR模型大鼠，运用多种染色方法系统地观察变应性鼻炎小鼠鼻腔黏膜的组织病理学情况，观察具有代表性的炎性细胞嗜酸性粒细胞、肥大细胞的浸润以及鼻粘膜中SP的变化，旨在从细胞及分子水平进一步研究变态反应的发病机制。探讨糖皮质激素是否能影响神经肽的表达以及神经肽是否参与变应性鼻炎中鼻粘膜嗜酸性粒细胞及肥大细胞的浸润过程。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组健康雄性豚鼠30只，体重150～220 g，于南华大学实验动物中心购买及喂养，保证湿度50%±5%，环境温度为22.5±2.5 ℃。保持室内环境清洁及安静通风，实验过程中，豚鼠能自由获取标准颗粒饲料(南华大学实验动物中心提供)、瓶装自来水喂养。

1.2主要试剂及药品雷诺考特(布地奈德鼻喷雾剂)，购自于南华大学附属南华医院；高纯卵清蛋白(ovalbumin，OVA)V级，购自于美国Sigma公司；甲苯胺蓝染色液，乙二胺四乙酸(EDTA)，P物质抗体，SP免疫组化学试剂盒，DAB显色试剂盒，氢氧化铝瓶装佐剂等均购自于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3动物模型的制备及处理30只健康雄性豚鼠抽签均分为正常对照组、糖皮质激素(布地奈德喷鼻剂)治疗干预组和变应性鼻炎模型组。变应性鼻炎模型组和布地奈德治疗干预组，参照经典动物造模方法,①基础致敏：腹腔内隔日注射7次，注射液是以卵清蛋白(ovalbu-min，OVA)0.3 mg+Al(OH)330 mg+生理盐水1 mL现配现用的混悬液；②局部激发：基础致敏结束后第一天即以每侧50 μL的2%OVA溶液滴鼻7天，每日1次。正常对照组同期以Al(OH)330 mg+生理盐水1 mL等量生理盐水腹腔注射行基础致敏，用同量生理盐水滴鼻局部激发。造模结束后立即行症状行为学评分并统计分析，模型建立后第1天干预组便开始连续3周的布地奈德喷鼻治疗，剂量20 μg/kg。其余两组均按体重同期同法生理盐水喷鼻。

1.4鼻部症状评分标准每次鼻腔局部末次激发后30分钟内观察并记录豚鼠鼻周阵发性剧烈前爪搔鼻动作、喷嚏次数、鼻涕情况，并参照国内学者标准[1]予以评分。在用布地奈德治疗的3周时间中，于第7天、第14天、第21天药物喷鼻后对实验对象进行同法评分。叠加记分具体方法见表1。

表1 三组大鼠鼻部症状学记分标准

1.5鼻黏膜取材、组织病理学切片及组织染色为期3周布地奈德喷鼻干预治疗结束后，用10%水合氯醛溶液(0.1 mL/20 g)行腹腔注射，全身麻醉后，游离取出鼻中隔两侧鼻黏膜，迅速将取下鼻中隔黏膜固定于4%多聚甲醛中,移入10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙后,常规石蜡包埋并低温保存标本、切片，切片厚4～5 μm。根据试剂盒说明书严格按实验步骤对组织标本进行苏木素—伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色及P物质免疫组化染色。

1.6鼻黏膜中SP的测定结果判断:显微镜下鼻黏膜上皮及黏膜下组织中出现浅黄色产物为弱阳性，棕黄色为阳性反应,强阳性则表现为深棕色产物。通过计算机图像分析软件可得出代表该切片SP表达水平的平均光密度值。平均光密度值与神经肽SP的表达呈正相关，镜下表现染色越深。

1.7统计分析上述数据以均数±标准差表示，应用SPSS 21.0统计学软件，单因素方差分析方法分析三组间的差异，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AR模型症状造模完成后模型组叠加总分明显高于对照组差异有统计学意义(P<0．05)。进一步干预实验完成后再次评分，模型组明显高于对照组和干预组(P<0．05),对照组和干预组比较，差异无统计学意义(P=0.507)。结果见表2。

表2 干预前后大鼠症状学叠加评分

2.2组织病理学改变

2.2.1 HE染色 各组HE染色见图1。对照组、干预组及组模型组每高倍视野下嗜酸性粒细胞浸润数分别为1.30±0.95、1.35±0.45、15.27±3.67。模型组可见鼻黏膜纤毛倒伏紊乱，部分有脱落甚至柱状上皮鳞化或坏死,黏膜下组织间质水肿,小血管扩张,大量嗜酸性粒细胞浸润，一定量的浆细胞、淋巴细胞等多种炎性细胞浸润。模型组鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞计数分别与对照组和干预组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组及干预组鼻黏膜无明显水肿,鼻黏膜无明显嗜酸性粒细胞及炎细胞浸润。两组差异无统计学意义(P=0.282)。见表3。

图1 三组豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润情况(HE染色400×)

组别nEOS计数FP对照组101.30±0.95129.000.00干预组101.35±0.45模型组1015.27±3.67

三组甲苯胺蓝染色显微镜下摄影见图2。对照组、干预组及组模型组每高倍视野下肥大细胞浸润数分别为1.30±0.52、1.31±0.36、10.02±3.17。模型组可见鼻黏膜纤毛倒伏紊乱，部分上皮脱落，黏膜下组织间质水肿,小血管扩张,着色的肥大细胞颜色深且数量较多，周围有颗粒状物围绕，体积偏大。而对照组、干预组缺少或无着色的肥大细胞。模型组肥大细胞计数分别与对照组和干预组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组及干预组鼻黏膜无明显水肿,鼻黏膜缺少或无着色的肥大细胞。两组差异无统计学意义(P=0.463)。见表4。

图2 三组豚鼠鼻黏膜肥大细胞浸润情况(甲苯胺蓝染色400×)

2.2.2 鼻黏膜中SP的免疫组化 三组SP免疫组化染色见图3。三组大鼠鼻粘膜中SP的光密度表达值见表5。鼻黏膜上皮细胞及其周围、固有层小血管、腺体周围及浸润于鼻粘膜的炎性细胞及其周围有SP的表达。光镜下为SP所在部位出现棕黄色阴影为阳性部位，强阳性则呈深棕色，浅黄色为弱阳性。对照组与干预组鼻黏膜上皮细胞及其周围、固有层小血管、腺体周围及浸润于鼻粘膜的炎性细胞及其周围SP的表达成弱阳性。模型组大鼠鼻黏膜中上述部位的阴影较对照组及干预相比明显增强。应用图像分析软件后可知模型组鼻黏膜中SP的平均光密度半定量值明显高于对照组和干预组,差异有统计学意义(P均<0.05)；对照组与干预组两组之间平均光密度半定量值差异无统计学意义(P=0.130)。

表4 豚鼻黏膜组织肥大细胞计数

表5 三组大鼠鼻粘膜中SP的平均光密度表达值

图3 三组豚鼠鼻黏膜P物质情况(免疫组化染色400×)

2.3 P物质与嗜酸性粒细胞及肥大细胞的相关性分析将20只AR模型(干预组及模型组)视为一整体进行统计分析，发现鼻黏膜中P物质表达与变应性鼻炎嗜酸性粒细胞浸润呈正相关，两者散点图见图4A；P物质表达与变应性鼻炎鼻黏膜中肥大细胞浸润也呈正相关(r=0.780,P<0.05)，两者散点见图4B。

图4 散点图 A:P物质与嗜酸性粒细胞;B:P物质与肥大细胞

3 讨 论

目前认为这些神经肽通过相应的受体作用于鼻粘膜的靶位点(相关炎性细胞)调控细胞基因的表达，通过促进细胞因子及细胞间黏附分子的合成来介导变应性炎症的发生发展[3]。Chalastras[4]等研究发现在变应性鼻炎患者的鼻粘膜中P物质和血管活性肠肽(VIP)表达明显增高，认为其在变应性鼻炎的免疫和超敏反应神经调节中发挥重要作用。Kavut[5]等研究证实了类似结论，证明变应性鼻炎患者的鼻粘膜中P物质表达增高，其发挥着重要作用。

本实验选取4～6周雄性大鼠，选用OVA行基础致敏及鼻内激发两个阶段，建立AR大鼠模型。造模结束后的症状行为学评分，模型及药物干预组豚鼠均激发出典型的AR症状。本研究应用HE染色及甲苯胺蓝染色观察AR模型鼻黏膜的病理组织改变情况，发现致敏组小鼠的鼻黏膜上皮细胞脱落、基底膜增厚，黏膜下间质水肿，局部微血管扩张，固有层内可见特征性的嗜酸性粒细胞浸润，肥大细胞浸润。鼻嗜酸性粒细胞、肥大细胞计数结果均提示AR模型造模成功。在模型组大鼠的鼻粘膜中，我们通过研究证实其P物质表达明显增高，且通过相关性分析发现鼻粘膜中P物质表达与嗜酸性粒细胞和肥大细胞数量有统计学相关性，表明P物质作为重要的神经肽在变应性鼻炎的发病过程中发挥着重要意义，推测其可能促进变态反应炎性效应细胞的浸润过程或炎性细胞通过产生P物质来参与发病过程。国内学者发现在变应性鼻炎鼻黏膜中浸润的肥大细胞周围有密集的肽能神经纤维末梢,肥大细胞被甲苯胺蓝染色阳性的同时证实其周围亦有SP物质免疫组织化学染色阳性阴影,认为这些肽能神经纤维能够作用于肥大细胞,通过肥大脱颗粒而释放组胺、白三烯等炎性介质，而肥大细胞所产生的组胺、白三烯等又可刺激肽能神经纤维末梢，促进SP与降钙素基因相关肽(CGRP)的进一步分泌[6]。肥大细胞还可通过释放类胰蛋白酶激活肽能神经表面的蛋白酶激受体-2，促进起合成并释放SP等神经肽，此项实验有力的肯定了肥大细胞与局部神经末梢之间的确存在着结构上和功能上的密切联系[7]。肥大细胞与神经肽之间相互作用模式丰富了对变应性鼻炎的认识。

国外研究揭示糖皮质激素喷鼻可通过减少神经肽含量来改善变应性鼻炎患者的临床症状，但两者间的具体作用机制人在探索当中[8]。在变应性鼻炎结膜炎患者中，糖皮质激素喷鼻治疗后测得其泪液中SP值明显下降，且眼结膜变应性炎症症状明显改善[9]。本研究组经3周的糖皮质激素治疗干预后,干预组切片HE染色、甲苯胺蓝染色和SP神经肽免疫组织化学染色显微镜下可发现大鼠鼻黏膜上皮细胞及其周围、固有层小血管、腺体周围的炎性细胞减少及其周围代表有SP的表达的平均光密度颜色变淡，表明鼻用激素的应用能有效一致鼻腔粘膜变态反应性炎症，其效应细胞如嗜酸性粒细胞和肥大细胞明显减少，同时P物质表达也显著降低，P物质和嗜酸性粒细胞以及肥大细胞的表达同样具有一致性，这一结论一方面表明了三者在致病过程中的重要关联，另一方面表明P物质在药物治疗过程中可能也是药物作用的重要靶点或效应之一。我们通过此研究证实了糖皮质激素抑制变应性炎症的机制与神经肽表达存在关联，其具体机制还需要进一步相关研究阐明。

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Effectofglucocorticoidontheinfiltrationofeosinophils,mastcellsandSPinnasalmucosaofguineapigswithallergicrhinitis

CHEN Zuyao,LUO Zhikui,ZHU Famei，et al

(DepartmentofOtorhinolaryngology，NanhuaHospitalAffliatedtotheUniversityofSouthChina，Hengyang421001,Hunan，China)

ObjectiveTo explore the effect of glucocorticoid on the infiltration of eosinophils,mast cells and substance P(SP) in nasal mucosa of guinea pigs with allergic rhinitis (AR).Methods30 of male guinea pigs were divided into normal control group (NG),allergic rhinitis groups (MG) and glucocorticoid treatment intervention group (GG) (n=10).Guinea pig model group set up by intraperitoneal injection of ovalbumin sensitization and bilateral nasal local excitation.GG was treated with glucocorticoid budesonide nasal spray treatment for 3 weeks,NG and MG treated with physiological saline nasal spray processing in the same period.Separation of guinea pigs nasal septum mucosa formaldehyde fixed immediately stained with HE and toluidine blue staining.SP was analysized with immunohistochemical method,and the acidophilic granulocyte and mast cells in nasal septum mucosa were counted under microscope.Immunohistochemical study of substance P average optical density was statistical analyzed.Resultscompared with the NG,semeiology scores of MG was meet the criteria for the diagnosis of allergic rhinitis,and have obvious eosinophils and mast cells infiltration.Compared to the MG,every index and symptom in GG was improved.ConclusionLocal application of budesonide can relieve symptoms of AR,reduce tissue inflammatory reaction,which may relate to inhibit the release of the SP of rhinitis nasal mucosa.

allergic rhinitis; eosinophils; mast cells; Substance P

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.004

2016-12-19；

2017-01-23

湖南省教育厅科研项目(13C803).

R765.21

A

秦旭平)