玻璃化冻存对斑马鱼卵母细胞的影响

方 晨，韦祥相，张 钊，李贤梅，张小雪

( 贵州大学 动物科学学院 水产系，贵州 贵阳 550025 )

玻璃化冻存对斑马鱼卵母细胞的影响

方 晨，韦祥相，张 钊，李贤梅，张小雪

( 贵州大学 动物科学学院 水产系，贵州 贵阳 550025 )

采用比色法测定了在不同玻璃化冻存液中冻存1、2、4、8 d时斑马鱼卵母细胞中谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶的活性，以研究玻璃化冻存对卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性的影响。试验结果显示，V4组斑马鱼(玻璃化液组分是：1.5 mol/L甲醇、6.0 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)卵母细胞冻存1、2、4、8 d后存活率最高[分别为(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%]，显著高于其他组。经玻璃化冻存后，斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性均随冻存天数的增加而显著下降(P<0.05)。V4组的谷胱甘肽含量[(13.37±0.59) mg/g]和线粒体三磷酸腺苷酶活性较高，线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶[(3.823±0.144) U/mg]、Mg2+-三磷酸腺苷酶[(4.503±0.144) U/mg]和Na+/K+-三磷酸腺苷酶[(7.520±0.198) U/mg]活性最高。各组细胞的活性随着冻存天数的增加而逐渐下降。试验结果表明，玻璃化冻存不能完全避免低温和冷冻保护剂的毒性和对卵母细胞的损伤。

斑马鱼；卵母细胞；玻璃化冻存；谷胱甘肽；线粒体三磷酸腺苷酶

斑马鱼(Daniorerio)原产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区，是一种常见的热带观赏鱼[1]。斑马鱼为重要的脊椎动物模式系统之一, 具有养殖水体小、成本低、繁殖周期短、产卵量大、品系资源丰富等特点及其他模式脊椎动物所不具备的胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等优势，已成为生命科学研究的新宠[2]。目前已对斑马鱼的胚胎发育、毒理、营养、生长、细胞分子等进行了广泛研究[3-9]，但尚未见到有关玻璃化冷冻对斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶活性的研究。

玻璃化冻存技术是近年来发展的一项新兴技术，是超低温保存技术中保存效果较好的一种方法。对卵母细胞进行玻璃化冻存可以建立雌性动物的基因库，保存物种的遗传多样性、优良品种及濒危动物的种质资源，为现代育种技术的发展提供技术支持；可以在任意时间内将冷冻的卵母细胞复苏，突破时间和空间的限制，解决鱼类的雌雄成熟不同步和远缘杂交等问题，对遗传育种具有重要意义，给水产养殖业带来新曙光[10-11]。

本研究检测了玻璃化冻存后斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性的变化， 探讨玻璃化冻存对卵母细胞存活率和酶活性的影响规律，分析了玻璃化冻存对卵母细胞造成的损伤及抗氧化能力的变化，以期为鱼类卵母细胞的冷冻保存及损伤机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

谷胱甘肽试剂盒与线粒体三磷酸腺苷酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，胶原酶Ⅱ型(索莱宝公司，北京)，台盼蓝(鼎国昌盛公司，北京)，青链酶素(索莱宝公司，北京)，DMEM培养液(Hyclone公司，美国)，蔗糖(索莱宝公司，北京)，甲醇(国药公司，上海)，乙二醇(国药公司，上海)等。

1.2 主要仪器

解剖镜(Olympus，SZ61型)，显微镜(Olympus，CH20型)，超净工作台(苏州净化，SW-CJ-ID型)，10 L液氮容器(成都，LSD-10)等。

1.3 主要溶液配制

胶原酶消化溶液：准确称量0.015 g胶原酶溶入1 mL DMEM培养液中配成15%的母液，保存在-20 ℃冰箱中备用。试验时将母液稀释50倍，配成0.3%的胶原酶溶液用于分解组织。

台盼蓝溶液：准确称量0.4 g台盼蓝，溶于10 mL 0.85%生理盐水中配成4%母液，保存在4 ℃冰箱中备用。试验时用生理盐水把母液稀释10倍，配成0.4%台盼蓝溶液，用于细胞染色检测细胞的存活率。

玻璃化冷冻液：参考Godoy等[12]试验，设计9种不同的玻璃化液配方，根据乙二醇的浓度分成3个大组，9个小组(表1)。

表1 玻璃化液配方 mol/L

注：A组：V1～V3，5.0 mol/L乙二醇；B组：V4～V6，6.0 mol/L乙二醇；C组：V7～V9，7.0 mol/L乙二醇.

1.4 样品制备

挑选发育成熟(腹腔饱满)的斑马鱼约150尾, 体质量(1.25±0.18) g，解剖取出两侧的卵巢，卵巢质量(0.26±0.04) g。

卵巢称量质量后放入青链霉素(100 U/mL)中涮洗1～2次，取出后放在载玻片上，用解剖刀切割成大小相同的小段(每小段30～50个卵母细胞)，然后放入胶原酶溶液中在20 ℃下酶解约20 min(酶解的时间以卵母细胞分解程度为判断标准)，用生理盐水涮洗卵母细胞3～4次，除去剩余的胶原酶，置0.85%生理盐水中室温保存备用。

1.5 卵母细胞的冷冻与复苏

将酶解后的卵母细胞放入0 ℃中，采用三步平衡法进行预平衡。具体操作为：取卵母细胞依次置于浓度为1/4倍、1/2倍和1倍的玻璃化液(原玻璃化液)中各平衡10 min，取出卵母细胞和相应的玻璃化液一起装到200 μL冷冻管中。将冷冻管直接放入液氮中，冻存时间分别为1、2、4 d和8 d。

将冷冻管从液氮中取出后直接放入37 ℃温水中，迅速振荡摇动使玻璃化液融化。融化后将卵母细胞快速转移到离心管中，加入0.5 mol/L的蔗糖溶液，摇匀，洗脱10 min，去上清液，再加入0.25 mol/L的蔗糖溶液，摇匀，洗脱10 min，去上清液。最后将卵母细胞转移到生理盐水中，摇匀，洗脱，去上清液，重复2次后加入生理盐水摇匀备用。

1.6 卵母细胞存活率检测

取出约30个卵母细胞，加入台盼蓝溶液常温下染色5 min，解剖镜和显微镜观察、拍照，计算细胞的存活率。

细胞的存活率=未染色的卵母细胞/卵母细胞总数×100%

1.7 线粒体三磷酸腺苷酶活性与谷胱甘肽含量的检测

采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定卵母细胞中的线粒体三磷酸腺苷酶活性和卵母细胞中谷胱甘肽含量，包括线粒体中Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶等3种三磷酸腺苷酶的活性，以每小时每毫克蛋白分解三磷酸腺苷产生1 μmol无机磷的量为1个三磷酸腺苷酶活性单位(U)。每毫克蛋白质每分钟扣除非酶促反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度下降1 μmol/L为1个酶活性单位(U)。

1.8 统计分析

所有试验均重复3次以上，数据以平均值±标准差表示，用Excel和SPSS 17.0进行分析，采用单因素方差分析比较多组样本的均数。

2 结 果

2.1 玻璃化冻存后卵母细胞的存活率

玻璃化冻存后各组(V1～V9组)卵母细胞的存活率都随冷冻天数的增加而显著下降，V1～V8各组卵母细胞的存活率在冻存1、2、4 d和8 d后明显下降，差异显著(P<0.05)，而V9组卵母细胞冻存4 d后存活率下降不显著(P>0.05)。冷冻1～8 d后，V4组卵母细胞存活率最高，显著高于其他组(P<0.05)，冻存1、2、4 d和8 d后分别为(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%(图1)。

2.2 玻璃化冻存后卵母细胞内线粒体三磷酸腺苷酶的活性

随着冷冻天数的增加，各试验组卵母细胞的线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性显著下降(图2)。V1～V7组在冻存1、2、4 d和8 d后线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性下降明显，差异显著(P<0.05)。V8组和V9组卵母细胞的线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性在1、2 d和4 d显著减少，差异显著(P<0.05)；4～8 d，线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性变化不大，差异不显著(P>0.05)。比较发现，V4组卵母细胞线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶在玻璃化冻存1、2 d和4 d后显著高于其他组(P<0.05)，其酶活性在冻存1、2、4 d和8 d后分别为(3.823±0.144) U/mg、(3.492±0.084) U/mg、(2.554±0.097) U/mg和(1.930±0.076) U/mg。

图1 不同的玻璃化液冻存下斑马鱼卵母细胞的存活率注：相同字母的平均值间差异不显著(P>0.05)，不同字母的平均值间差异显著(P<0.05)，下同.

图2 不同的玻璃化液冻存下斑马鱼卵母细胞线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性

随着冷冻天数的逐渐增加，各试验组卵母细胞的线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性下降(图3)。V1、V3、V4、V5、V6和V8组在1、2、4 d和8 d后线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶活性显著下降，差异显著(P<0.05)。V2、V7和V9组在1 d、2 d和4 d后线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶活性显著减少，差异显著(P<0.05)；4～8 d，线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶活性变化不大，差异不显著(P>0.05)。比较表明，V4组卵母细胞的线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶活性在冻存1、2、4 d和8 d后显著高于其他组(P<0.05)，其酶活力在冻存1、2、4 d和8 d分别为(4.503±0.144) U/mg、(4.134±0.182) U/mg、(2.972±0.096) U/mg和(2.113±0.073) U/mg。

随着冻存天数的增加，各试验组卵母细胞的线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性显著下降(图4)。V1～V7组在1、2、4 d和8 d后，线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性显著下降，差异显著(P<0.05)。V8和V9组在1～2 d和2～4 d，线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性显著减少(P<0.05)；4～8 d，线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性变化不大，差异不显著(P>0.05)。V4组的线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性在冻存1、2、4 d和8 d后显著高于其他组，其酶活力在1、2、4 d和8 d分别为(7.520±0.198)、(5.828±0.184)、(3.204±0.197) U/mg和(2.031±0.176) U/mg。

2.3 玻璃化冻存后卵母细胞谷胱甘肽的含量

随着冷冻天数的增加，各试验组斑马鱼卵母细胞中谷胱甘肽含量显著减少(图5)。V1、V4、V5、V6和V7组卵母细胞中谷胱甘肽含量在冻存1、2、4 d和8 d后显著减少(P<0.05)。V2、V3、V8、V9组在冻存1、2 d和4 d后的谷胱甘肽含量下降幅度大，差异显著(P<0.05)，但在4 d后谷胱甘肽含量变化不大，无显著性差异(P>0.05)。虽然冷冻1 d后卵母细胞中V5组的谷胱甘肽含量比V4组要高一些，但差异不显著(P>0.05)，而V4组卵母细胞谷胱甘肽含量在2、4 d和8 d均都高于V5组，且差异显著(P<0.05)。综合来看，V4组冻存后卵母细胞谷胱甘肽含量最高，显著高于其他组(P<0.05)，在经过1、2、4 d和8 d冻存后，谷胱甘肽含量分别为(13.37±0.59)、(10.57±0.73)、(6.25±0.89) mg/g和(4.16±0.57) mg/g。

图3 不同玻璃化液冻存下斑马鱼卵母细胞线粒体Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性

图4 不同的玻璃化液冻存下斑马鱼卵母细胞线粒体Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性

图5 不同玻璃化液冻存下斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽的含量

3 讨 论

3.1 玻璃化冻存对鱼卵母细胞线粒体三磷酸腺苷酶活性的影响

Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶均属三磷酸腺苷酶，对维持细胞的生理功能起重要作用[13]。关于低温冻存对三磷酸腺苷酶活性影响的研究大多集中于冷冻保存的精子；冻存后三磷酸腺苷酶活性大多显著下降[14-17]。三磷酸腺苷酶作为广泛分布于有机体中一种极为重要的膜蛋白酶，在卵母细胞冻存后的变化研究不多。

本试验发现，卵母细胞冻存后，Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶的变化规律相似，活性均显著下降；卵母细胞中谷胱甘肽含量也显著下降，说明清除氧自由基的能力减弱，线粒体产生的大量氧自由基又作用于线粒体膜，引起膜脂质氧化损伤，甚至会引起细胞坏死、自溶，影响了三磷酸腺苷酶活性，导致其活性下降。也有可能在降温与复温过程中，部分损伤了线粒体，使线粒体三磷酸腺苷酶的分布发生改变，甚至引起酶的活力降低或失活；也有可能是冷冻保护剂的毒性破坏了线粒体的结构，引起酶复合蛋白体解聚，引起酶系结构和功能的变化，降低了线粒体三磷酸腺苷酶活性。

3.2 玻璃化冻存对鱼卵母细胞谷胱甘肽含量的影响

[1] 孙智慧, 贾顺姬, 孟安明. 斑马鱼:在生命科学中畅游[J]. 生命科学, 2006, 18(5):431-436.

[2] 贾顺姬, 孟安明. 中国斑马鱼研究发展历程及现状[J]. 遗传, 2012, 34(9):1082-1088.

[3] 郭恩棉. 斑马鱼卵巢发育的组织学研究[J]. 青岛农业大学学报:自然科学版, 2009, 26(3):229-232.

[4] 王晶, 王冰, 李纪同,等. 斑马鱼性腺发育的组织学观察[J]. 基因组学与应用生物学, 2011, 30(2):168-174.

[5] 王佳佳, 徐超, 屠云杰,等. 斑马鱼及其胚胎在毒理学中的实验研究与应用进展 [J]. 生态毒理学报, 2007, 2(2):123-135.

[6] 陈微, 章琳俐, 杨平,等. 斑马鱼端脑的微细形态与结构[J]. 水产学报, 2015,39(3):371-380.

[7] 侍建涛, 桂建芳, 周莉,等. 斑马鱼-cDNA克隆与表达分析[J]. 水生生物学报, 2015, 39(3):459-467.

[8] 杨少斌, 冯婧文, 赵文铖,等. 斑马鱼TATA结合蛋白的生物信息学分析[J]. 生命科学研究, 2015(2):119-123.

[9] 端正花, 陈晓欧, 刘灵丽,等. 苯并三唑和镉对斑马鱼肝脏的联合毒性效应[J]. 中国环境科学, 2015, 35(6):1872-1876.

[10] 章海敏, 姜红强, 虞效益. 鱼类卵母细胞玻璃化冻存的研究进展及前景展望[J]. 现代农业科技, 2016(6):240-242.

[11] 陈松林. 鱼类配子和胚胎冷冻保存研究进展及前景展望[J]. 水产学报, 2002, 26(2):161-168.

[12] Godoy L C,Streit D P, Zampolla T, et al. A study on the vitrification of stage Ⅲ zebrafish (Daniorerio) ovarian follicles [J].Cryobiology, 2013, 67(3):347-354.

[13] 齐静, 侯红平, 张广平,等. 黄药子水提物对小鼠肝毒性及其线粒体ATP酶和超氧化物歧化酶的抗氧化机制[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2016, 30(8): 802-807.

[14] 闫秀明, 张小雪. 超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响[J]. 水生生物学报, 2011, 35(5):882-886.

[15] 陈亚敏. 鞍带石斑鱼精子低温保存研究[D]. 湛江：广东海洋大学,2013.

[16] 浦蕴惠, 许星鸿, 高焕,等. 超低温冷冻对脊尾白虾精子几种酶活性的影响[J]. 水产学报, 2013, 37(1):101-108.

[17] 黄晓荣, 章龙珍, 庄平,等. 超低温冷冻对日本鳗鲡精子酶活性的影响[J]. 海洋渔业, 2008, 30(4):297-302.

[18] 张绘芳. 还原型谷胱甘肽的作用机制及临床应用[J]. 医学信息, 2015, 3(31):385-390.

[19] 樊跃平, 于健春, 余跃,等. 谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价[J]. 中华临床营养杂志, 2003, 11(2):136-139.

[20] 黄晓荣, 章龙珍, 庄平,等. 超低温保存对罗氏沼虾胚胎几种酶活性的影响[J]. 海洋渔业, 2010, 32(2):166-171.

EffectsofVitrifiedCryopreservationonGSHContentandMitochondrialATPaseActivityinOocytesofZebrafishDaniorerio

FANG Chen, WEI Xiangxiang, ZHANG Zhao, LI Xianmei, ZHANG Xiaoxue

( Animal Science College, Guizhou University, Guiyang 550025, China )

The effects of vitrified cryopreservation on glutathione(GSH) content and mitochondrial ATPase activity in oocytes were investigated in zebrafish(Daniorerio) cryopreservated in different vitrification solutions for 1 d, 2 d, 4 d and 8 d by a chromatometry method. The results showed that the maximal survival rate was observed in the oocytes cryopreservated in group V4 in which the vitrification solution was consisted of 1.5 mol/L methanol, 6.0 mol/L ethylene glycol and 0.25 mol/L sucrose, with survival rate of (48.89±2.58)% in 1 d, (39.35±1.34)% in 2 d, (24.18±2.32)% in 4 d, and (14.56±1.64)% in 8 d, significantly higher than in other groups (P<0.05). The GSH contents and the activities of mitochondrial ATPase in zebrafish oocytes were found to be significantly decreased with increase in elapse of vitrified cryopreservation (P<0.05), with the maximal GSH contents and activities of mitochondrial ATPase in group V4, including Ca2+-ATPase of(3.823±0.144) U/mg, Mg2+-ATPase of (4.503±0.144) U/mg and Na+/K+-ATPase of(7.520±0.198) U/mg. The oocytes exposed to the vitrification solutions showed lower cytoactive as the increase in vitrification time, indicating that vitrification did not completely avoid the damages to zebrafish oocytes caused by the low temperature and the toxicity of cryoprotectants.

Daniorerio; oocyte; vitrification cryopreservation; glutathione; mitochondrial ATPase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.014

S965.8

A

1003-1111(2017)06-0773-05

2016-12-06；

2017-03-27.

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金资助项目[黔省专合字(2009)102号].

方晨(1992—)，男，硕士研究生；研究方向：水产动物繁殖与发育.E-mail：1727105435@qq.com.通讯作者：张小雪(1962—)，女，教授；研究方向：水产动物繁殖与发育.E-mail：zhangxx508@163.com.