蝇蛆蛋白对中华鳖血清生化指标及非特异性免疫功能的影响

程逍妹，黄启成，王方海，李广宏

( 1.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275； 2.广东绿卡现代农业集团公司，广东 东莞 523912 )

蝇蛆蛋白对中华鳖血清生化指标及非特异性免疫功能的影响

程逍妹1，黄启成2，王方海1，李广宏1

( 1.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275； 2.广东绿卡现代农业集团公司，广东 东莞 523912 )

在室内、外养殖试验中将家蝇蛆磨成蝇浆，按一定比例配以卵磷脂、几丁寡糖和多种维生素制成蝇蛆蛋白，研究其对中华鳖血液生化指标及非特异性免疫功能的影响。在水温(25±1) ℃的室内养殖试验中，将36只体质量(248.15±17.10) g的中华鳖，随机分成3组(重复3次，每重复4只)饲养在120 cm×60 cm×55 cm水族箱中，分别投喂基础饲料、15%蝇蛆蛋白+基础饲料、30%蝇蛆蛋白+基础饲料，养殖180 d。室外养殖池面积为0.5 hm2，鳖体质量(294.05±12.265) g，每口池塘放雄鳖7200只，投喂基础饲料和15%蝇蛆蛋白+基础饲料，养殖120 d。试验结果表明，室内养殖的中华鳖摄食添加15%和30%蝇蛆蛋白时，血清总蛋白、总胆汁酸、甘油三酯含量及碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及溶菌酶活性均显著高于对照组；15%添加组中华鳖的血清生化指标除血清总蛋白显著低于30%添加组外，总胆汁酸和甘油三酯含量与30%添加组差异不显著；虽然15%添加组的碱性磷酸酶活性显著低于30%添加组，但酸性磷酸酶和溶菌酶活性则显著高于30%添加组。室外养殖试验结果表明，投喂添加15%蝇蛆蛋白饲料组的中华鳖血清总蛋白、总胆汁酸、甘油三酯含量、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及溶菌酶活性均显著高于投喂基础饲料组。攻毒试验结果表明，投喂15%蝇蛆蛋白的中华鳖累积死亡率(26.67%)显著低于对照组(83.33%)，相对保护率为67.99%。室内外养殖结果证明，在饲料中添加15%蝇蛆蛋白能增强中华鳖的非特异性免疫功能。

蝇蛆蛋白；中华鳖；血清；生化指标；非特异性免疫

高密度集约化养殖的发展常导致养殖环境的恶化，中华鳖(Trionyxsinensis)的病害流行日趋严重，造成了巨大损失[1]。抗生素虽能有效预治各种疾病，但一系列副作用同样给养殖带来了灾难。应用免疫增强剂来提高中华鳖非特异性免疫能力以预防疾病，是一种极为有效的方法。

家蝇(Muscadomestica)幼虫(俗称蝇蛆)营养丰富，蛋白质含量高，还含有抗细菌、真菌、病毒的生物活性肽、凝集素和溶菌酶等。这些抗菌物质效力极高，只要万分之一用量便可杀死多种病菌，远高于目前人类已发现的任何抗菌素。研究表明，蝇蛆蛋白可以增强对虾[2-4]、鱼类[5-8]、海参[9]和鸡[10]等的免疫力，是一种既能为养殖动物提供优质蛋白，又可增强机体抗病力的天然免疫增强剂。有关蝇蛆粉替代鱼粉对中华鳖日本品系生长、免疫力、抗病力及肌肉品质的影响已有报道。如用蝇蛆粉替代饲料中50%的鱼粉能显著增强中华鳖血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性，但对抗氧化指标和溶菌酶活性无显著影响[11]。而有关蝇蛆活性蛋白对中华鳖血液生化指标及非特异性免疫的影响迄今尚未见报道。为此，笔者研究了蝇蛆活性蛋白对中华鳖血清生化指标及非特异性免疫的影响，旨在为中华鳖免疫增强剂的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

血清检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。其余同《蝇蛆蛋白对中华鳖生长性能及营养品质的影响》。

1.2 方法

将蝇蛆磨成浆、提取及浓缩，再按一定比例配以卵磷脂、壳寡糖和多种维生素等制成蝇蛆蛋白。

1.2. 1 室内饲养试验

试验方法同《蝇蛆蛋白对中华鳖生长性能及营养品质的影响》。试验结束时取鳖血测定血液生化与免疫指标。

1.2.2 室外饲养试验

试验方法同《蝇蛆蛋白对中华鳖生长性能及营养品质的影响》。试验结束时取鳖血测定血液生化与免疫指标。

1.2.3 指标测定

试验结束时，室内、外饲养试验的每个处理分别随机取3只和30只，用乙醚麻醉，酒精消毒中华鳖腹甲中间区域后，切开消毒部位体壁，小心剥除血管表面黏膜露出3条大血管，然后用一次性采血针从左体动脉弓取血5 mL，室温放置1 h，4 ℃，3000 r/min离心15 min，取血清，-80 ℃保存备用。

测定血清中总蛋白、甘油三脂、总胆汁酸含量。血清生化指标采用全自动生化分析仪(OLYMPUS-AU600)测定。

血清中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和溶菌酶活性用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

中华鳖的抗菌力按下列方法测定：从室外养殖90 d的试验组和对照组随机捞取中华鳖各30只，分别腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)菌液，密度为5.0×109cfu/mL，每只注射0.2 mL，于120 cm×60 cm×55 cm水族箱中养殖，水深15 cm，水温(25±1) ℃，每个水族箱放养5只。每日观察死亡情况，连续观察15 d，计算死亡率和相对免疫保护率。

相对免疫保护率/%=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准差表示，采用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，用Duncan′s多重比较法分析试验结果的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 蝇蛆蛋白对中华鳖血液生化指标的影响

2.1.1 蝇蛆蛋白对室内养殖中华鳖血液生化指标的影响

室内养殖中，各添加不同蝇蛆蛋白的中华鳖血清总蛋白含量均随蝇蛆蛋白添加量的增加而显著高于对照组；各添加组鳖血清总胆汁酸和甘油三酯含量均显著低于对照组，但添加组间差异不明显。从血液生化指标考虑，在中华鳖饲料中添加30%蝇蛆蛋白比添加15%的效果更佳，但从经济角度考虑，添加15%的蝇蛆蛋白较为适宜(表1)。

2.1.2 蝇蛆蛋白对室外养殖中华鳖血液生化指标的影响

室外养殖中华鳖摄食添加蝇蛆蛋白饲料时，血清总蛋白含量显著高于对照组，而总胆汁酸和甘油三酯含量则显著低于对照组(表2)。

2.2 蝇蛆蛋白对中华鳖免疫指标的影响

2.2.1 蝇蛆蛋白对室内养殖中华鳖免疫指标的影响

室内养殖的各试验组中华鳖血清中碱性磷酸酶的活性依次为添加30%蝇蛆蛋白组>添加15%蝇蛆蛋白组>对照组，各组间差异显著；酸性磷酸酶和溶菌酶的活性均为添加15%蝇蛆蛋白组>添加30%蝇蛆蛋白组>对照组，各组间也差异显著，以添加15%蝇蛆蛋白最佳(表3)。

表1 室内养殖中华鳖摄食添加蝇蛆蛋白饲料时血液生化指标的变化

注：同列数据后不同英文字母表示差异显著(P<0.05)，下同.

表2 室外养殖中华鳖摄食添加蝇蛆蛋白饲料时血液生化指标的变化

表3 室内养殖中华鳖摄食添加蝇蛆蛋白饲料时血液免疫指标的变化

2.2.2 蝇蛆蛋白对室外养殖中华鳖免疫指标的影响

室外养殖的中华鳖摄食含15%蝇蛆蛋白的饲料时，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性均显著高于对照组(表4)。

2.3 蝇蛆蛋白对中华鳖抗感染能力的影响

摄食添加15%蝇蛆蛋白饲料的中华鳖注射嗜水气单胞菌菌液15 d的累积死亡率显著低于对照组，相对保护率为67.99%(表5)。

表4 室外养殖中华鳖摄食添加蝇蛆蛋白饲料时血液免疫指标的变化

表5 蝇蛆蛋白对中华鳖抗感染能力的影响

3 讨 论

3.1 蝇蛆蛋白对中华鳖血液生化指标的影响

血清蛋白成分及其含量变化与机体健康、营养和疾病等状况密切相关，是衡量免疫功能及机体状态的指标，良好的营养状况可使血清蛋白维持在较高的水平[12-13]；胆汁酸是胆固醇经过肝脏合成的有机酸，是肝脏清除胆固醇的主要形式，其生成和代谢与肝脏器官的功能紧密相关。当肝细胞受损时，血浆总胆汁酸含量就升高，因此总胆汁酸是反映肝细胞分泌、合成、肝细胞损伤状态的重要指标[14]；三酰甘油是反应体内脂肪代谢水平的重要生理指标，三酰甘油的含量升高，表明肝中堆积的脂肪较多，易导致脂肪肝和肝肥大等症状[13]。本试验结果表明，在中华鳖饲料中添加蝇蛆蛋白可显著提高中华鳖血清总蛋白，降低总胆汁酸和甘油三酯，说明添加蝇蛆蛋白可促进中华鳖对饲料中蛋白质的吸收与利用，保肝护肝，有效防止脂肪肝的发生，其中以添加15%蝇蛆蛋白最为适宜。这与用鲜蝇蛆、蝇蛆抗菌肽或蝇蛆粉增加了鸡血清总蛋白含量的结果一致[15-17]，也与蝇蛆抗菌肽可降低鸡血清总脂的结果一致[16]，而与在饲料中添加蝇蛆粉对肉鸡血清总蛋白和总胆固醇含量无显著影响的结果不符[18]，其中的原因有待进一步查明。

3.2 蝇蛆蛋白对中华鳖免疫指标的影响

碱性磷酸酶普遍存在于动植物体内，是一种对底物专一性要求较低的磷酸单脂水解酶和解毒系统，在碱性条件下，可使磷酸单脂水解生成乙醇和磷酸，与一些营养物质的消化吸收有关[19]；酸性磷酸酶是巨噬细胞溶酶体的标志酶，也是巨噬细胞内最有代表性的水解酶。吞噬是巨噬细胞的典型功能之一，巨噬细胞吞噬异物颗粒形成吞噬体，然后用包括酸性磷酸酶在内的溶解酶消化异物颗粒，酸性磷酸酶的活性代表着吞噬细胞清除异物的能力，也就是非特异性免疫能力[20]；溶菌酶能破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽而导致细胞壁破裂，逸出内容物，使细菌溶解，是体液免疫的主要参与者[21]。碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶是3种重要的非特异性免疫酶，在中华鳖体液免疫和抗病过程中具有重要作用。这些酶活力的高低常被用作评价中华鳖免疫机能状态的重要指标。本试验发现，在饲料中添加15%或30%的蝇蛆蛋白可显著提高中华鳖血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶的活性，表明基础饲料中添加15%或30%蝇蛆蛋白显著增强了中华鳖非特异性免疫。这一结果与青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[5]、仿刺参(Apostichopusjaponicus)[9]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[22]、黄鳝(Monopterusalbus)[7]及泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[8]的研究结果一致；也与蝇蛆粉提高中华鳖碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的结果一致[11]，但与蝇蛆粉对中华鳖日本品系的溶菌酶活性没有影响的结果不同[11]，推测可能与产品的加工方式有关，因为不同的加工工艺会导致蝇蛆活性物质丧失。分析蝇蛆蛋白对中华鳖血液生化指标及相关免疫酶活性的影响发现，蝇蛆蛋白不仅具有调节中华鳖免疫的功能，还具有调节中华鳖代谢的作用，但机理尚待进一步研究。

3.3 蝇蛆蛋白对中华鳖抗感染能力的影响

攻毒试验可以客观评价生物体对于外界病原菌的抵抗能力，直观反映机体免疫能力强弱。明建华等[23]通过嗜水气单胞菌攻毒试验发现，摄食含有蝇蛆粉饲料的青鱼存活率显著高于对照组。陈乃松等[4]分别用含有蝇蛆粉和β-葡聚糖的饲料喂凡纳滨对虾一段时间后，再用溶藻胶弧菌进行攻毒，结果蝇蛆粉组和β-葡聚糖组的对虾抵抗力均显著高于对照组，其中又以蝇蛆粉组抵抗力最强。在凡纳滨对虾饲料中添加0.3%家蝇抗菌肽，饲养8周后进行白斑病病毒攻毒试验[22]，结果表明，抗菌肽组72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低。本研究中，各试验组中华鳖经嗜水气单胞菌攻毒表明，投喂蝇蛆蛋白组中华鳖的死亡率明显低于对照组。该结果与蝇蛆粉及家蝇抗菌肽的试验一致，但由于本研究使用的蝇蛆蛋白产品，加工简单，生产成本低，因此更易于被用户接受，有利于产品推广应用。大多数鱼类产生特异性抗体需要长期适应和产生记忆而形成[23]。本试验中的中华鳖相对保护率提高，应与蝇蛆蛋白提高了鳖体碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等非特异性免疫酶的活性有关。考虑到蝇蛆生产成本，笔者建议在中华鳖饲料中以添加15%蝇蛆蛋白为宜。

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EffectsofDietaryHouseflyMaggotProteinonSerumBiochemicalIndicesandNonspecificImmunityinSoftShelledTurtleTrionyxsinensis

CHENG Xiaomei1，HUANG Qicheng2，WANG Fanghai1，LI Guanghong1

( 1. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China; 2. Guangdong Luka Modern Agriculture Group Co., LTD, Dongguan 523912, China )

Two feeding trials were conducted to investigate the effects of housefly maggot (Muscadomestica) protein supplemented with lecithin, chitosan and vitamins on serum biochemical indices and nonspecific immunity of soft shelled turtleTrionyxsinensis. Thirty-six individuals of soft shelled turtle with body weight of (248.15 ±17.10) g were reared in a 120 cm×60 cm×55 cm tank and fed on one of the experimental diets supplemented with 0%，15% and 30% housefly maggot protein in a laboratory at water temperature of (25±1) ℃ for 180 d with triplication. Soft shelled turtle with body weight of(294.05±12.265) g were stocked into an outdoor tank with 0.5 hm2at a density of 7200 individuals and fed on one of the experimental diets supplemented with 0% and 15% housefly maggot protein for 120 d. Results showed that the levels of serum protein, total bile acid, and triglyceride, and activities of alkaline phosphatase, acid phosphatase and lysozyme were significantly higher in soft shelled turtle fed the diets containing 15% and 30% housefly maggot protein than those in the soft shelled turtle in the control group. The soft shelled turtle fed the diet containing 15% housefly maggot protein had lower serum biochemical indices than the turtle fed the diet containing 30% housefly maggot protein did, without significant differences in levels of total bile acid and triglyceride in both groups. The soft shelled turtle in 15% housefly maggot protein group had lower alkaline phosphatase activity and higher acid phosphatase and lysozyme activities than the soft shelled turtle in 30% housefly maggot protein group. Considering the housefly maggot production cost, it is suggested that supplementation with 15% housefly maggot protein was optimal for soft shelled turtle culture. The toxic challenge test revealed that there was significantly lower mortality (26.67%) in the turtle fed the diet containing 15% housefly maggot protein than that in control group (83.33%), indicating that the housefly maggot protein is a good food source for soft shelled turtle, resulting in significant increase in serum biochemical index and nonspecific immunity.

housefly maggot protein；Trionyxsinensis；serum；biochemical index；nonspecific immunity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.013

S966.5

A

1003-1111(2017)06-0768-05

2016-12-06；

2017-03-23.

广东省海洋渔业科技推广专项(A201301F02)；广东省渔业标准化专项(2013)；清远市科技计划项目(2013C008).

程逍妹(1990—)，女，硕士研究生；研究方向：动物营养与免疫. E-mail：cxm0929@126.com. 通讯作者：李广宏(1964—)，男，副教授，硕士生导师；研究方向：动物营养与生理. E-mail：lsslgh@mail.sysu.edu.cn.