白斑综合症病毒在日本囊对虾精养池塘中的动态变化

王庚申，施 慧，谢建军，汪 玮，何 杰，许文军

( 1. 浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山316021； 2. 浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021 )

白斑综合症病毒在日本囊对虾精养池塘中的动态变化

王庚申1,2，施 慧1，谢建军1，汪 玮1，何 杰1，许文军1

( 1. 浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山316021； 2. 浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021 )

用实时荧光定量PCR技术检测了高密度精养池塘中日本囊对虾体内及浮游动物白斑综合症病毒携带量的动态变化，检测结果显示，两口池塘的日本囊对虾苗种均携带白斑综合症病毒，达2.43×105～9.42×105IU/mg；浮游动物也携带微量白斑综合症病毒，达6.78×102～8.02×102IU/mg。在整个养殖过程中，日本囊对虾多个组织均携带白斑综合症病毒，平均病毒量为鳃>肌肉>肝胰腺>胃；各组织病毒携带量的变化趋势不一致，肌肉、肝胰腺、胃等呈现明显的先降后升趋势，最低降至1.78×103IU/mg，鳃白斑综合症病毒携带量的下降幅度较小，最低为7.29×104IU/mg。浮游动物的病毒量在白斑综合症爆发前波动不明显，发病时急剧升高。综合认为，苗种携带是白斑综合症病毒的主要来源；当养殖进入中后期，底质变差、水温降至病毒适宜复制的温度时，易爆发白斑综合症。

日本囊对虾；浮游动物；白斑综合症病毒；荧光定量 PCR

日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)俗称花虾、车虾、竹节虾等，在中国、日本、东南亚国家、澳大利亚、非洲国家及红海等海区均有分布，具有耐低温、耐干露、色泽绚丽、味道鲜美、经济价值高等优点，是我国重要的海水养殖经济虾类之一[1-2]。近年来，日本囊对虾养殖技术得到不断的完善和提高，工厂化和高位池精养模式成为主要的养殖模式[3]。白斑综合症是近二十年来危害我国乃至世界对虾养殖业最主要的疾病，被世界动物卫生组织列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一[4]。该病发病快，感染率和致死率极高，通常情况下对虾在感染后约3～5 d内死亡率达100%[5]。由于日本囊对虾对白斑综合症病毒抵抗力较弱，加上亲体普遍未经过无病化选育，导致虾苗携带白斑综合症病毒，在养殖过程中极易爆发白斑综合症。目前，针对白斑综合症尚缺乏有效的治疗措施，尽早发现病毒并及早采取预防措施是防控白斑综合症的有效策略[6-7]。

病毒携带量是决定白斑综合症爆发与否的关键指标。徐丽美等[8]通过定量PCR 方法初步将每毫克组织含103个病毒粒子作为白斑综合症爆发的危险临界值。因此，监测宿主体内的病毒量变化对于判断白斑综合症病毒感染进程具有重要意义。本研究旨在利用实时定量PCR技术，定期对高密度精养池塘日本囊对虾体内及浮游动物的白斑综合症病毒携带量进行检测，以期精确地反映白斑综合症病毒在日本囊对虾体内和浮游动物中的增殖变化规律，为高密度精养日本囊对虾防控白斑综合症提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验条件

试验在浙江省舟山市华祥水产有限公司进行。选取2个日本囊对虾高密度精养池塘，编号为26#、31#，面积分别为0.07 hm2、0.09 hm2。池塘为正方形，池底和四周用水泥浇灌，池底铺沙20～30 cm，水深1.8～2.0 m，养殖用水经50 mg/L漂白粉消毒后，第3 d使用。池塘配备22.5 kW/hm2水车增氧机及底部PVC增氧管。放苗时间为2015年7月20号，虾苗长0.7～0.8 cm，放苗密度105万尾/hm2。

1.2 样品采集

1.2.1 对虾样品

2口日本囊对虾高密度精养池塘，从放苗开始连续跟踪其养殖全程，每10 d取样一次。因2口塘均因白斑综合症爆发导致养殖终止，26#池塘跟踪取样共计60 d，31#池塘共计70 d。试验虾均为活虾，每次随机采集对虾样品30尾/塘，分别取日本囊对虾的鳃、肌肉、肝胰腺、胃等组织，用75%酒精固定。

1.2.2 浮游动物

用13号浮游生物网捞取浮游动物，低温保存带回实验室。经3000 r/min离心5 min，去杂质，灭菌生理盐水清洗干净用于DNA提取。

1.3 样品DNA的提取

30尾样品虾随机分为3组，任选1组，并分别取10尾虾的鳃和肌肉组织混合成1个样品，鳃总质量(14.91±1.83) mg，肌肉总质量(16.90±2.23) mg，肝胰腺组织总质量(17.71±2.53) mg，胃总质量(7.73±0.92) mg；浮游生物总质量(20.45±1.19) mg。各组织样品DNA用Qiagen DNA提取试剂盒提取，-20 ℃保存备用。

1.4 引物与探针

用于Real-time PCR检测白斑综合症病毒的引物和探针设计参考文献[9]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物和探针的序列

1.5 实时定量PCR检测

Real-time PCR检测白斑综合症病毒的方法参照文献[10]所建立的方法，20 μL反应体系包括：10 μL 2×TransStart® Probe qPCR SuperMix，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，10 μmol/L探针0.4 μL，模板DNA 2 μL，补充双蒸水至20 μL。试验在罗氏LightCycler480上进行。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。每个样品重复3次，并设置空白对照。

1.6 标准品的制备和标准曲线的建立

阳性质粒标准品根据文献[9]方法制备。10倍梯度稀释阳性质粒并对其进行扩增，用于制备标准曲线。

2 结果与分析

2.1 浮游动物白斑综合症病毒携带量的动态变化

2口池塘中浮游动物白斑综合症病毒携带量动态变化见图1。26#池塘浮游动物白斑综合症病毒量在养殖前50 d保持平稳，基本维持在102IU/mg水平，在养殖60 d时升至6.23×103IU/mg；31#池塘病毒携带量的第一个波动高峰出现在9月8日，达到了1.32×103IU/mg，随后出现下降；9月28日白斑综合症爆发，病毒量高达3.0×103IU/mg。由此可见，浮游动物病毒携带量快速上升与日本囊对虾爆发白斑综合症时间同步。

图1 浮游动物白斑综合症病毒携带量动态变化

2.2 日本囊对虾白斑综合症病毒携带量的动态变化

2.2.1 鳃白斑综合症病毒携带量的动态变化

2口池塘的日本囊对虾苗种均携带白斑综合症病毒，其中鳃病毒携带量超过105IU/mg。在养殖前20 d，2口池塘的鳃病毒量波动较平稳，20 d之后出现下降，但幅度较小，最低携带量分别为7.29×104IU/mg、9.83×104IU/mg；在养殖第50 d时又升至105IU/mg以上水平。在白斑综合症爆发前，鳃病毒量最高为9.42×105IU/mg和1.15×106IU/mg，爆发之后达到了1.53×109IU/mg和8.68×108IU/mg。在整个养殖过程中，鳃组织病毒量均超104IU/mg，说明日本囊对虾处于高风险的养殖状态(图2)。

图2 鳃白斑综合症病毒携带量动态变化

2.2.2 肌肉白斑综合症病毒携带量的动态变化

2口池塘日本囊对虾肌肉白斑综合症病毒携带量变化见图3。在养殖10 d后，2口池塘日本囊对虾肌肉白斑综合症病毒量均出现下降，随后26#池塘肌肉病毒量为3.80×103～ 3.26×104IU/mg，直至发病时达2.08×108IU/mg，最低值出现在8月19日；31#池塘肌肉病毒量持续降至103IU/mg水平，最低值为1.52×103IU/mg，在9月8日快速升至3.30×105IU/mg，之后逐渐升高，至9月28日白斑综合症爆发时达到1.50×108IU/mg。

图3 肌肉白斑综合症病毒携带量动态变化

2.2.3 肝胰腺白斑综合症病毒携带量的动态变化

2口池塘日本囊对虾肝胰腺白斑综合症病毒携带量均先降后升。26#池塘病毒量为1.78×103～3.24×104IU/mg，发病时高达1.18×108IU/mg，最低值出现在8月9日。31#池塘日本囊对虾肝胰腺病毒量低于26#池塘，波动范围为1.79×103～ 2.10×104IU/mg，发病时高达2.89×108IU/mg(图4)。整体上看，肝胰腺白斑综合症病毒携带量低于肌肉。

图4 肝胰腺白斑综合症病毒携带量动态变化

2.2.4 胃白斑综合症病毒携带量的动态变化

2口池塘日本囊对虾胃白斑综合症病毒携带量动态变化见图5。胃病毒携带量动态变化与肝胰腺基本一致，呈现先降后升的趋势。26#池塘胃病毒量在8月9日降至4.99×103IU/mg，随后在2.84×103～1.20×104IU/mg波动，发病时达到8.29×109IU/mg；31#池塘胃病毒量也在8月9日降至103IU/mg水平，随后其波动范围为1.89×103～6.52×104IU/mg，发病时高达2.67×107IU/mg。

图5 胃白斑综合症病毒携带量动态变化

3 讨 论

3.1 日本囊对虾携带白斑综合症病毒动态变化

本研究利用TaqMan探针法荧光定量PCR对高密度精养池塘日本囊对虾体内白斑综合症病毒携带量进行了监测，结果表明，2口池塘的日本囊对虾苗种均携带白斑综合症病毒，携带量达2.43×105～9.42×105IU/mg，属于中度感染。从病毒携带量动态变化规律来看，鳃组织变化幅度较小，仅在8月份样品中最低降至7.29×104IU/mg，而肌肉、肝胰腺、胃等组织均呈现明显的先降后升趋势，最低降至1.78×103IU/mg。王奕玲等[11]利用实时定量PCR对高密度精养池塘对虾白斑综合症病毒携带量进行跟踪调查，结果显示，养殖前期各个池塘对虾白斑综合症病毒携带量均有一定程度上升，与本试验中养殖前期保持稳定或有所下降不同，可能与本次试验的日本囊对虾苗种白斑综合症病毒携带量较高有关。当养殖前期水体环境优良，对虾免疫力较强时，病毒难以快速复制。从组织分布来看，日本囊对虾多个组织均携带白斑综合症病毒，平均病毒量为鳃>肌肉>肝胰腺>胃。战文斌等[12]采用单克隆抗体FAT的原位观察病毒在日本囊对虾体内增殖，结果显示鳃、皮下组织和血窦中感染强度最高，与本试验荧光定量结果比较一致。而刘波等[13]用套氏PCR和斑点杂交的方法研究了白斑综合症病毒在日本囊对虾不同组织内的分布，结果显示肌肉和附肢扩增出的目的条带明显好于鳃、肝胰脏和心脏等其他组织， 与本试验结果有所差异，原因可能是病虾处于不同的感染阶段[14]。

3.2 浮游动物病毒携带量与日本囊对虾的关系

有研究表明，浮游动物是白斑综合症病毒的中间宿主[15-16]，同时又可作为饵料被对虾摄食[17-18]，因此检测养殖水体中浮游动物的病毒携带量对判断浮游动物与白斑综合症爆发之间的关系具有重要意义。本试验中，浮游动物白斑综合症病毒携带量在白斑综合症爆发前变化不明显，为6.78×102～8.02×102IU/mg。当日本囊对虾发病时，浮游动物病毒携带量急剧升至逾103IU/mg，这也证实了在对虾发病季节，浮游动物携带病毒的强度也会上升[19]。在整个养殖过程中，浮游动物病毒携带量的变化趋势与鳃相似，但与肌肉、肝胰腺、胃等先降后升的趋势明显不同，同时，浮游动物病毒携带量也极显著低于日本囊对虾组织(P<0.01)。

3.3 白斑综合症爆发原因及病毒来源

笔者发现，水温长期处于约25 ℃和底质变差是两口池塘白斑综合症爆发的主要原因。有研究认为，25 ℃是白斑综合症病毒的最佳复制温度[20-21]，当病毒数量超过一定阀值时造成白斑综合症爆发。当养殖进入中后期，大量的残饵、粪便、死亡藻类在沙层积聚使底质变差，消耗大量溶解氧形成氧债，一定程度上抑制了对虾的新陈代谢，对虾抗病力下降，病毒易感性往往大幅提高。从病毒来源来看，白斑综合症病毒主要来自日本囊对虾虾苗，且平均病毒量超过105IU/mg，养殖水体中的浮游动物也携带微量病毒。因此，获得不携带病毒的日本囊对虾苗种和做好水体消毒是降低白斑综合症爆发风险的重要途径。

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VariationinWSSVinKurumaShrimpMarsupenaeusjaponicasCulturedandZooplanktoninIntensiveFarmingPonds

WANG Gengshen1,2, SHI Hui1, XIE Jianjun1, WANG Wei1,HE Jie1, XU Wenjun1

( 1. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China; 2. Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province,Zhoushan 316021, China )

The variation in white spot syndrome virus (WSSV) infection intensity of kuruma shrimpMarsupenaeusjaponicasand zooplankton were quantified in intensive farming ponds by real-time PCR. The results showed that the shrimp larvae in the ponds carried WSSV at concentrations from 2.43×105to 9.42×105IU/mg; the zooplankton carried WSSV at concentrations from 6.78×102to 8.02×102IU/mg. Four tissues (gill, muscle, stomach and hepatopancreas) of kuruma shrimp carried WSSV genomes through the entire farming perid. The maximal mean number of WSSV copies were observed in the gill and the minimal mean number of WSSV copies in the stomach. The variation of WSSV in the tissues was different. The variation in amounts of WSSV genome showed first decrease then increase in the tissues (muscle, stomach and hepatopancreas) with the minimal value 1.78×103IU/mg. The WSSV genome amount in the gill was decreased, less than the other tissues, with the minimal value of 7.29×104IU/mg. The amounts of WSSV in the zooplankton had no obvious fluctuation before the breakout of WSS, and increased rapidly after the breakout of WSS. The findings indicated that the main source of WSSV in the ponds was shrimp seed; WSS was easily outbreak during the middle and later rearing periods, when the sediment was polluted and the water temperature decreased at the WSSV vulnerable temperature of kuruma shrimp.

Marsupenaeusjaponicas; zooplankton; WSSV; real-time PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.012

S945.4

A

1003-1111(2017)06-0763-05

2016-10-26；

2017-02-03.

浙江省科技厅项目(2015F30003, 2015F50004).

王庚申(1988-)，男，工程师，硕士；研究方向：海水健康养殖. E-mail:wgs-1988@163.com.通讯作者：许文军(1971-)，男，教授级高级工程师；研究方向：海水健康养殖. E-mail:xwenjun@sina.com.