中国东北部山区细鳞鱼4个群体遗传多样性分析

闫春梅, 杜晓燕, 郑 伟，刘慧吉，肖志国，张家松，杨晓波

( 1.吉林省水产科学研究院，吉林 长春 130033；2.和龙市青龙渔业有限公司，吉林 延吉 133000 )

中国东北部山区细鳞鱼4个群体遗传多样性分析

闫春梅1, 杜晓燕1, 郑 伟1，刘慧吉1，肖志国1，张家松1，杨晓波2

( 1.吉林省水产科学研究院，吉林 长春 130033；
2.和龙市青龙渔业有限公司，吉林 延吉 133000 )

采用微卫星法，利用11对微卫星引物对黑龙江省松花江流域、吉林省图们江支流红旗河流域、吉林省白山市鸭绿江流域及吉林省图们江支流密江流域随机采集的94尾细鳞鱼样本进行遗传多样性分析，探讨4个不同流域细鳞鱼群体的遗传多样性差异及其亲缘关系。结果显示，4个群体共检测到等位基因147个，各群体有效等位基因数为1.6541～2.4143，平均观测杂合度为0.3849～0.5186，平均期望杂合度为0.3488～0.5003，4个群体平均多态信息含量为0.3320～0.4704。亲缘关系分析显示，红旗河流域群体与密江流域群体遗传距离最小(0.0954)，亲缘关系最近。松花江流域群体与其他3个群体的遗传距离较大，亲缘关系较远。群体间相似指数在0.7112以上，相似性较高。

细鳞鱼；遗传多样性；微卫星

细鳞鱼(Brachymystaxlenok)，属鲑形目、鲑科、细鳞鱼属，属名贵冷水性经济鱼类，营养价值和经济价值均较高，在我国主要分布于黑龙江、图们江、鸭绿江、松花江、辽河支流太子河、河北省小滦河上游、秦岭及额尔齐斯河等，目前仅在中国东北部有较集中分布。由于生态环境破坏和人为因素的双重影响，细鳞鱼自然繁殖受到影响，生殖亲体出现退化趋势，种群数量逐年减少，分布范围日趋缩小，野生资源量急剧衰退，已列入中国濒危动物红皮书(鱼类)，属国家二级保护水生野生动物，濒危种。近年来，对细鳞鱼物种的保护逐渐受到重视，先后有水产行业专家学者对细鳞鱼生存环境[1]及其生物学特性[2]、人工繁育[3]、遗传多样性[4-8]等方面展开研究。本研究在诸多研究基础上，应用微卫星分子标记方法，对分布于黑龙江省松花江流域、吉林省图们江支流红旗河流域、吉林省白山市鸭绿江流域及吉林省图们江支流密江流域的细鳞鱼群体进行了遗传多样性分析及其亲缘关系比较研究，旨在进一步为细鳞鱼种质资源保护及遗传改良和合理有效地开发利用提供分子生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用细鳞鱼组织样品来源于中国东北部山区4个不同地域，分别为黑龙江省松花江流域，随机采集11尾，命名为松花江群体；吉林省图们江支流红旗河流域，随机采集30尾，命名为红旗河群体；吉林省白山市鸭绿江流域，随机采集23尾，命名为鸭绿江群体；吉林省图们江支流密江流域，随机采集30尾，命名为密江群体。所有鳍条组织样品均保存于95%乙醇中。

基因组DNA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。引物合成委托上海生物工程有限公司完成。

1.2 基因组DNA提取

保存于95%乙醇中的组织样品经超纯水清洗后晾干，应用基因组DNA提取试剂盒提取所有组织样品基因组DNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计法测定其含量和纯度，采用灭菌超纯水稀释至100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.3 引物合成及PCR扩增

NCBI查找相关细鳞鱼微卫星引物序列27对，合成普通引物。对普通引物进行可用性筛选，摸索引物条件和体系。进行PCR扩增后产物上2%琼脂糖凝胶电泳检测，确认符合目的长度的引物11对，引物序列见表1。

对上一步得到有条带的引物进行荧光引物合成，在其中1条引物的5′端加FAM/HEX/Tamra标记。对所有DNA样品进行PCR扩增检测，PCR反应体系为10 μL[Primers (10 mmol/L)0.4 μL，10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，50 nmol/L MgCl20.4 μL，Taq 酶 0.04 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 6.96 μL]。94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s,退火30 s，72 ℃延伸30 s，5个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物上3730 xl基因分析仪检测。

表1 用于微卫星分析引物序列

1.4 数据统计

应用Popgen 32软件进行数据处理，分别完成等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、群体间遗传距离和相似指数、聚类分析、哈迪温伯格平衡检验(P值)以及平均多态信息含量计算。

2 结果与分析

2.1 群体遗传多样性分析

筛选出的11个位点在4个群体中的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、平均多肽信息含量和哈迪温伯格平衡数据见表2。由表2可见，4个群体94个样品，应用11对微卫星引物进行DNA检测，共检测到等位基因147个，其中松花江群体24个、红旗河群体50个、鸭绿江群体43个、密江群体30个。由于不同群体检测的等位基因不一致，共获得51个不同等位基因。其中每个位点等位基因数2～7个。OMM1008和OMM1077各检测到7个等位基因，OMM1044和OMM1105在松花江群体和密江群体两个群体分别只有1个等位基因，在其他两个群体中为2～5个等位基因。

各群体有效等位基因数为1.6541～2.4143，平均观测杂合度为0.3849～0.5186，平均期望杂合度为0.3488～0.5003。其中红旗河群体的上述指标数值均为最高。

利用平均多态信息含量计算软件计算4个群体平均多态信息含量为0.3320～0.4704，红旗河群体的多肽信息含量为最高(0.4704)。除OMM1044和OMM1105为低多态性位点(平均多肽信息含量<0.25)，OMM1077和TL35为高度多态(平均多肽信息含量>0.5)，其他7个位点均为中度多态(0.25<平均多肽信息含量<0.5)。

11对微卫星引物在4个群体中检测的44个位点中，OMM1044和OMM1105在松花江群体和密江群体两个群体中为单态，对其他40个多态位点进行分析，29个位点符合哈迪温伯格平衡(P>0.05)，其他11个位点均有偏离哈迪温伯格平衡(P<0.05)的群体，偏离哈迪温伯格平衡的现象在4个群体均存在。本试验11对引物中有4对引物(OMM1007、OMM1008、OMM1039、OMM1077)在4个群体中均符合平衡。

2.2 群体间遗传结构

11对引物对4个群体进行PCR扩增，产物条带经聚类分析显示，红旗河群体与密江群体遗传距离最小(0.0954)，亲缘关系最近。松花江群体与其他3个群体的遗传距离较大，亲缘关系较远(表3，图1)。

通过基因流和群体间遗传分化系数可见(表3)，4个群体间的遗传分化系数值为0.0580～0.1751，其中松花江群体—鸭绿江群体间的遗传分化系数值最高(0.1751)。松花江群体—密江群体和松花江群体—红旗河群体的群体间遗传分化系数值仅次于松花江群体—鸭绿江群体。红旗河群体—鸭绿江群体和红旗河群体—密江群体的群体间遗传分化系数值最低。4个群体间的基因流值为1.1930～4.0581。其中红旗河群体与鸭绿江群体和密江群体两群体间的基因流值较高，分别为4.0581和3.6423。

表2 4个细鳞鱼群体的11个微卫星位点的遗传多样性分析

(续表2)

位点群体等位基因数有效等位基因数观测杂合度期望杂合度多态信息含量哈迪温伯格平衡检验OMM1044松花江群体11.00000.00000.00000.00000.000000**红旗河群体41.31960.06670.24630.23210.000536**鸭绿江群体42.55560.34780.62220.54930.047738*密江群体11.00000.00000.00000.00000.000000**OMM1077松花江群体32.14160.81820.55840.43160.073314红旗河群体64.11900.66670.77010.71680.080230鸭绿江群体75.53140.77270.83830.79530.225080密江群体42.15050.70000.54410.45840.508318OMM1105松花江群体11.00000.00000.00000.00000.000000**红旗河群体51.32060.26670.24690.23350.999754鸭绿江群体21.18880.17390.16230.14620.592661密江群体11.00000.00000.00000.00000.000000**TL24松花江群体21.11720.11110.11110.09951.000000红旗河群体41.93940.54170.49470.40210.932953鸭绿江群体53.56230.47830.73530.67510.045465*密江群体21.18030.16670.15540.14160.546181TL35松花江群体32.39600.45450.61040.50750.467053红旗河群体52.82570.53330.65710.60430.359580鸭绿江群体42.76960.60870.65310.56800.043662*密江群体21.99120.60000.50620.37390.299619平均值松花江群体2.18181.66740.38490.34920.3320红旗河群体4.54552.41430.51860.50030.4704鸭绿江群体3.90912.37820.42600.49420.4378密江群体2.72731.65410.42100.34880.3500

注:*:P<0.05; **:P<0.01.

表3 4个群体的遗传分化系数及基因流

注：对角线以下为群体间遗传分化系数，对角线以上为基因流.

表4 4个群体的遗传距离和相似性指数

注：对角线以下为遗传距离，对角线以上为遗传相似指数.

图1 4个群体的UPGMA聚类图

3 讨 论

微卫星法是检测共显性遗传特征的分辨率很高的较新遗传学研究方法，目前已成为种群遗传结构与进化分析的有效分子标记。本试验利用微卫星法分析了4个不同流域细鳞鱼群体的遗传多样性和遗传结构。

3.1 遗传多样性

遗传多样性是衡量一个种群种质资源质量的重要指标。遗传多样性越高，进化潜力越大[9]。本研究主要从等位基因数、杂合度、多态信息含量、哈迪温伯格平衡等几个方面对4个不同流域细鳞鱼群体的遗传多样性进行分析。平均杂合度是被检测位点上群体的杂合子频率，用于检测群体内遗传变异，是群体杂合程度的度量单位。杂合度高低与遗传多样性丰度和群体对环境的适应能力成正相关[10]。本试验中，4个群体平均有效等位基因数为1.6541～2.4143，平均观测杂合度0.3849～0.5186，平均期望杂合度0.3488～0.5003。表明4个群体遗传多样性均较丰富，尤其是红旗河群体，群体平均观测杂合度0.5186，平均期望杂合度0.5003，遗传多样性高于其他3个群体，对环境适应能力较强，具有较丰富的育种和遗传改良潜力，应采取相应措施予以保护。

除杂合度以外，还可以通过平均多肽信息含量来检测多态性，从而来度量遗传多样性和基因丰富程度。Botstein等[11]认为，当平均多肽信息含量<0.25时为低度多态位点，0.25<平均多肽信息含量<0.5时为中度多态位点，平均多肽信息含量>0.5时为高度多态位点。本研究中11个微卫星位点中包括2个低度多态性位点、7个中度多态性位点和2个高度多态性位点，位点多态性较丰富。对4个群体分析结果表明，4个群体的平均多态信息含量为0.3192～0.4704，介于0.25～0.5之间，证明群体间遗传多样性中等，4个群体均属于中度多态性。

哈迪温伯格平衡是指在一个群体无限大，且又具备随机交配、没有突变、没有选择、没有遗传漂变的情况下，群体内一个位点上的基因型频率和基因频率将保持世代不变，处于遗传平衡状态[12]。本研究中11个微卫星引物在4个群体中均观测到显著偏离平衡情况，40个多态位点中11个位点偏离平衡(P<0.05)。这种现象可能与样本量及无效等位基因的存在有关[13]。

3.2 群体间遗传结构

本研究的目的是检验4个细鳞鱼群体的遗传关系，因此，遗传距离和遗传相似度是重要的衡量指标。在群体的进化研究中，可通过计算遗传距离来鉴定种间遗传结构及分化关系。微卫星研究方法认为遗传距离越远，分化时间越长，杂种优势越大，即遗传距离与分化关系呈正相关。1982年Thorp综合一系列研究认为，遗传距离大于0.05同时小于0.3为同种不同群体；遗传距离大于0.3同时小于0.9为同属不同种；遗传距离大于0.9为不同属[14]。本试验4个群体间遗传距离均大于0.0954，认为4个群体间发生了遗传分化。其中松花江群体与鸭绿江群体遗传距离为0.3408，稍高于0.3，认为种群间开始发生种的分化，其他3个群体遗传距离均小于0.3，认为种群间已发生群体分化，为同种不同群体。综合来看，4个群体间虽有分化，但分化程度不高。聚类分析结果也证实红旗河群体与密江群体首先聚为一支，松花江群体单独分为一支。出现这一结果的原因可能是红旗河群体与密江群体均属吉林省图们江支流，地理位置相对较近，因此聚为一支；而鸭绿江群体属吉林省鸭绿江流域，与红旗河群体与密江群体同属吉林省但流域不同，因此遗传距离稍远；松花江群体则属于黑龙江省松花江流域，地理位置最远，所以单独分为一支。

此外，基因流和群体间遗传分化系数也可用来分析群体间遗传分化程度。基因流<1说明群体分化程度较大，1<基因流<4则是分化程度一般，基因流>4说明群体间该位点的遗传分化程度较小[15]。本研究中4个群体之间的基因流值均大于1.1930，表明群体间发生了一般程度的基因交流，而红旗河群体与鸭绿江群体和密江群体两群体间的遗传分化程度更小，基因流值分别为4.0581和3.6423。遗传分化系数是反映种群间的遗传分化程度的重要指标。当 0<遗传分化系数≤0.05时, 表明群体遗传分化较弱;0.05<遗传分化系数≤0.15时, 表明群体遗传分化中等; 0.15<遗传分化系数≤0.25时,表明群体遗传分化较大; 遗传分化系数>0.25时,表明群体遗传分化很大[16]。本研究中松花江群体与另外3个群体种群间的遗传分化系数分别为0.1402、0.1751、0.1733，遗传分化程度较大，红旗河群体与鸭绿江群体和密江群体两群体间的种群间遗传分化系数分别为0.0580、0.0642，鸭绿江群体和密江群体的种群间遗传分化系数为0.1391。证明其遗传分化程度中等。此结论与群体间聚类分析结果基本一致。本研究分析的4个中国东北部山区细鳞鱼群体遗传多样性可见，4个群体遗传多样性均较高，特别是红旗河群体，具有一定的遗传潜力，可作为选育群体。建议人工繁殖时选取遗传距离较远的个体作为亲本，同时对同一繁殖群体可进行不同地理区域放流，以增加群体遗传多样性，保证种质资源永续利用。

[1] 高燕.鸭绿江上游支流细鳞鱼(Brachymystaxlenok)的生态环境调查及人工增殖研究[D].长春:东北师范大学, 2004.

[2] 白庆利, 牟振波, 于洪贤, 等. 野生细鳞鱼的生物学特性及繁殖力[J].水产学杂志, 2007，20(1):69-73.

[3] 牟振波, 刘洋, 徐革锋, 等.细鳞鱼摄食和生长最适水温的研究[J].水产学杂志,2011，24(4):6-8，24.

[4] 王荻, 徐革锋, 刘洋, 等.细鳞鱼三个野生种群的遗传多样性AFLP分析[J].农业生物技术学报,2009，17(4):638-644.

[5] 徐革锋, 牟振波, 薛淑群, 等.不同流域细鳞鱼染色体遗传多态性分析[J].水生生物学报,2009，33(5):975-979。

[6] 原居林, 朱俊杰, 王高学.秦岭细鳞鲑黑河种群和湑水河种群的遗传多样性分析[J]. 南方水产, 2009，5(3):63-66.

[7] 张艳萍, 王太, 杜岩岩, 等.秦岭细鳞鲑人工繁育群体与野生群体遗传变异分析[J].水生生物学报, 2014, 38(5):828-833.

[8] 马波, 姜作发.乌苏里江2种细鳞鲑种群遗传多样性及亲缘关系的微卫星分析[J]. 中国水产科学, 2007, 14(1):39-45.

[9] 程雪艳, 滕爽爽, 肖国强, 等.基于微卫星的泥蚶5个地理群体遗传多样性分析[J]. 海洋科学, 2015, 39(11):116-125.

[10] 邹杰, 马爱军, 赵艳飞, 等.利用微卫星标记分析3个暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)养殖群体的遗传多样性[J].渔业科学进展,2015,36(2):55-62.

[11] Botstein D, White R L, Skolnick M,et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3):314-331.

[12] 黄代新, 杨庆恩.卡方检验和精确检验在HWE检验中的应用[J]. 法医学杂志, 2004, 20(2):116-119.

[13] 王鹤, 王田田, 胡丽萍, 等.仿刺参中国群体与韩国群体杂交子代微卫星标记分析[J].水产科学,2016, 35 (1):60-66.

[14] Shaklee J B, Tamaru C S, Waples R S. Speciation and evolution of marine fishes studied by the electrophretic analysis of proteins[J]. Pac Sci, 1982, 36(2):141-157.

[15] 刘博, 匡友谊, 佟广香, 等.微卫星分析9个哲罗鱼野生群体的遗传多样性[J].动物学研究,2011, 32(6):597-604.

[16] Weight S. Evolution and the genetics of population, Volume 4: variability within and among natural population Chicago[M]. Chicago:University of Chicago Press, 1987.

GeneticDiversityofFourPopuationsofLenokBrachymystaxlenokinMountainAreaofNortheastChina

YAN Chunmei1, DU Xiaoyan1, ZHENG Wei1, LIU Huiji1, XIAO Zhiguo1, ZHANG Jiasong1, YANG Xiaobo2

( 1.Jilin Fisheries Research Institute, Changchun 130033，China; 2.Helong Qinglong Fisheries Limited Company, Yanji 133000，China )

The genetic diversities and relationship were investigated in ninety-four individuals of lenok(Brachymystoxlenok) collected from Songhua river basin in heilongjiang province, Jilin Tumen river tributary of Red Flag river basin, Jilin Baishan Yalu river basin and Jilin Tumen river tributary of Mijiang river basin by 11 pairs of microsate llite primers and by SSR. The results showed that 147 alleles were detected in the four populations, with effective allele number (Ne) of 1.6541-2.4143, average observed heterozygosity of 0.3849-0.5186, and the average expected heterozygosity of 0.3488-0.5003. Four populations of lenok had the average polymorphism information content (PIC) of 0.3320-0.4704. The phylogenetic relationship analysis indicated that the Red Flag river group and the Mijiang river group had the minimal genetic distance(0.0954), with the close tgenetic relationship. The Songhuajiang group showed larger genetic distance than the other 3 groups did, with similarity index of over 0.7112 between groups.

Brachymystaxlenok; genetic diversity; microsatellite

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.015

S917

A

1003-1111(2017)06-0778-06

2016-10-24；

2016-12-29.

吉林省省级公益性科研院所行业科研项目；吉林省现代农业产业技术体系建设项目(2015-2016).

闫春梅(1981-)，女，工程师，硕士；研究方向：预防兽医学、水产养殖. E-mail：yanchunmei199950@126.com.通讯作者：杜晓燕(1961-)，女，研究员；研究方向：水产生物. E-mail: dxypa@tom.com.