高效液相色谱法测定垂盆草-柴胡药对不同比例配伍中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量

蒋志涛，吕玲燕，汪铜芳，2，陈晓峰，巫静华*

(1.南京中医药大学附属张家港医院 江苏省企业研究生工作站，江苏 张家港 215600；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

高效液相色谱法测定垂盆草-柴胡药对不同比例配伍中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量

蒋志涛1，吕玲燕1，汪铜芳1，2，陈晓峰1，巫静华1*

(1.南京中医药大学附属张家港医院 江苏省企业研究生工作站，江苏 张家港 215600；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

目的考察垂盆草配伍柴胡后对总黄酮煎出量的影响。方法使用高效液相色谱法分别对单味垂盆草药材的水煎液及不同比例垂盆草柴胡配伍后的单煎合液及合煎液中3种黄酮的总含量进行测定。结果不同比例垂盆草柴胡配伍的单煎合液中总黄酮的含量与垂盆草单煎液并无显著性差异，合煎液中总黄酮的含量显著增加。结论垂盆草配伍柴胡对总黄酮的煎出有促进作用。

垂盆草；柴胡；配伍；总黄酮

垂盆草具有利湿退黄、清热解毒的功能，可用于湿热黄疸、小便不利、痈肿疮疡的治疗，垂盆草与其他药物配伍后可增强其疏肝健脾、利湿退黄的效果[1-3]。在中医药理论中，垂盆草配伍柴胡具有非常广泛的应用，如益肝乐颗粒，全方由垂盆草、柴胡、郁金等药材组成，用于湿热蕴蒸、身目俱黄或两胁痞满、疼痛、体倦懒食、溲赤便溏、舌苔黄腻等，急、慢性肝炎属上述证候者。垂盆草能利湿退黄、清热解毒，柴胡则可疏肝解郁、升举阳气，两药配伍用有非常广泛的药理作用[4-6]。杨洁文等[7]通过使用不同剂量柴胡垂盆草汤灌胃对化疗药物(匹服平)所致的肝损伤小鼠的保护作用，发现治疗组与模型组血清学测试及病理学表现均存在显著性差异。垂盆草配伍柴胡前期多注重药理学方面的研究，对其化学成分的研究却很少见[8-10]，本文以高效液相色谱法观察垂盆草与柴胡不同比例配伍对垂盆草有效成分槲皮素、山柰素、异鼠李素3种黄酮总含量煎出率的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪、Waters 2998二极管阵列检测器、Epower2化学工作站、分析天平(Shimadzu Aux220)。

1.2 材料

槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品(成都曼斯特科技开发有限公司，批号分别为13122506、14010701、13053007)；甲醇为色谱纯(德国默克)；水为娃哈哈纯净水；盐酸为分析纯。

垂盆草、柴胡药材饮片均来自张家港市中医医院药剂科，经张家港市中医医院余辉副主任中药师鉴定均符合2015版《中华人民共和国药典》一部项下规定。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

按表1规定处方量准确称取各味药，充分混匀后分别置于1000 mL烧瓶中，加8倍量水，煮沸后1 h，用4层医用纱布过滤，残渣加8倍水重复以上过程，合并2次滤液，定容至药材总重的20倍量，采取相同的加水倍数、煎煮次数及煎煮时间，分别煎煮，每组平行制备两份。精密量取垂盆草及柴胡单煎液，配制成垂盆草与柴胡煎出液分别为2∶1、1∶1、1∶2的单煎合液适量。每组平行制备两份即得1～8号样品溶液。

表1 不同药物配比组成

2.2 HPLC检测

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Hedera ODS-2(200 mm×4.6 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选用不同比例的0.4%磷酸溶液(A)∶甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，条件见表2。

2012年镇江市积极采取措施进行智慧城市建设并取得一定成效［2］。2016年在《镇江市“十三五“规划纲要》中，镇江市人民政府明确提出要推进“智慧镇江”建设，全面提升一体化基础设施建设水平。2018年镇江市荣获“2018中欧绿色智慧城市奖”。目前镇江智慧城市建设已经进入发展新阶段。扬中市智慧城市建设一方面能够为镇江下属县级市例如丹阳、句容、丹徒等提供建设样本，以点带面整体推进镇江全市范围内的智慧建设；另一方面，扬中市加强与镇江产业合作创新，对传统产业进行升级转型，促进经济共享、资源共享、共同发展，为镇江经济社会发展贡献力量，进一步推动“智慧镇江”建设。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素19.20、5.01、5.25 mg，分别置于不同的10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀备用。分别取1 mL上述对照品溶液置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，制成每1 mL含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密吸取上述样品溶液20 mL，置于蒸发皿中，水浴锅上蒸干，精密量取甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，用上述混合溶液补足重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性考察 分别精密吸取混合对照品溶液和1号供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定。色谱图见图1。结果显示，在供试品溶液中槲皮素、山柰素、异鼠李素与对照品有相同的保留时间。

2.4.2 专属性试验 在与样品测定完全相同的条件下，精密吸取2号供试品项下的柴胡水煎液10 μL，连续进2针，发现阴性无干扰，色谱图见图1中C。说明垂盆草中槲皮素、山柰素、异鼠李素专属性较强。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.槲皮素；2.山柰素；3.异鼠李素。图1 对照品、供试品、阴性对照溶液的HPLC图

2.4.3 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液各1、2、4、6、10、12 μL进样，测定峰面积，以槲皮素、山柰素、异鼠李素的进样量(μg)为横坐标X，以三者峰面积为纵坐标Y，各自进行线性回归，槲皮素线性回归方程：Y=3 072 031.2X-13 231.4，r=0.999 9；山柰素的线性回归方程：Y=3 062 657.1X-6 241.3，r=0.999 8；异鼠李素的线性回归方程：Y=2 583 461.7X-9 123.2，r=0.999 9。结果表明，槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在0.076 8～1.92、0.020 04～0.501、0.021～0.525 μg线性关系良好。

2.4.4 精密度试验 精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合对照品溶液，按照2.2项下色谱条件，重复进样6次进行分析测定，进样量均为10 μL。分别测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积，结果计算得出槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为0.7%、0.8%、1.2%，表明精仪器的精密度良好，可用于进一步试验分析。

2.4.5 稳定性试验 精密吸取同一份样品(垂盆草单煎液)按供试品溶液的制备方法，于室温(20～25 ℃)下放置，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，每次进样10 μL，按2.2项下色谱条件进行测定，记录6次峰面积，结果10 h内RSD为0.98%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.4.6 重复性试验 精密吸取同一份样品(垂盆草单煎液)，按供试品溶液的制备方法，共平行制备6份，分别精密吸取10 μL，按2.2项下色谱条件进行测定，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均含量分别为1.14、0.32、0.48 mg·g-1，各成分含量的RSD分别为1.2%、1.1%、1.4%，均符合要求，结果表明该方法重复性良好。

2.4.7 加样回收率试验 精密量取同一份样品(垂盆草单煎液)10 mL，共6份，分别精密加入一定量的槲皮素对照品溶液(1.92 mg·mL-1)、山柰素对照品溶液(0.501 mg·mL-1)、异鼠李素对照品溶液(0.525 mg·mL-1)，上述溶液按2.1项下供试品溶液的制备方法分别制备6份，按2.2项下色谱条件进样，分析测定，测定方法的回收率。测定结果见表3～5。

表3 槲皮素的加样回收率试验结果(n=6)

表4 山柰素的加样回收率试验结果(n=6)

表5 异鼠李素的加样回收率试验结果(n=6)

2.5 样品测定

精密吸取2.1项下表1中除柴胡单煎液外的各样品溶液，按供试品溶液的制备方法，每个配比平行制备两分，共14份，分别精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合对照品溶液及各供试品溶液各10 μL，连续进2针，采用随行标准，用外标一点法测定，即得各个样品3种黄酮成分的总含量，结果见表6。

表6 样品测定结果(n=3)

注：与垂盆草单煎液比较▲P< 0.01。

精密吸取各样品10 μL，分别进样3次，按外标法计算3种黄酮类总含量，计算平均值，所得结果见表6。实验结束，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学处理(P<0.01)组间差异采用Dunett-t检验。

3 讨论

药理学研究证明，垂盆草中黄酮类成分具有抗肝组织纤维化、保肝降酶、保护肝细胞的作用[11-16]。《中华人民共和国药典》2015版把槲皮素、山柰素、异鼠李素作为控制垂盆草药材的质量指标，因此，本实验研究以3种黄酮的总含量作为考察的指标。垂盆草与柴胡相须为用，可增强保肝降酶、止痛之力。有研究表明，在垂盆草与柴胡配伍的诸多方剂中，两者以1∶1配伍比例出现频率最多。因此我们选择2∶1、1∶1、1∶2的不同配伍比例进行研究。

在本实验选定的色谱条件下，3种黄酮成分得到较好的分离，无杂峰干扰测定。垂盆草单煎液与柴胡-垂盆草配伍水煎液是按照传统中药煎煮方法平行操作制得，以此来考察煎煮过程中柴胡对垂盆草总黄酮的影响。单煎合液采用两种药材单独煎煮后所得的煎液按比例混合，以此考察两者简单混合时柴胡对垂盆草总黄酮煎出率的影响。两种情况综合考虑，研究单独煎煮合并和合煎的合理性，据此研究柴胡-垂盆草配伍对3种黄酮类成分的影响是科学可行的。

垂盆草单煎液中总黄酮煎出量为(1.964 7±0.468 3)mg·g-1，合煎液3种配比组成总黄酮煎出量依次为(2.107 3±0.004 1)、(2.136 0±0.019 4)、(2.249 2±0.003 2)mg·g-1，单煎合液不同配比总黄酮含量依次为(1.932 9±0.001 6)、(1.923 2±0.008 8)、(1.946 4±0.020 2)mg·g-1。由上可知，单煎合液与垂盆草单煎液相比，不存在显著性差异(P>0.01)，说明在混合的过程中，柴胡对垂盆草中的总黄酮无显著影响。合煎液中总黄酮煎出量与垂盆草单煎液相比含量显著增加(P<0.01)，说明柴胡垂盆草合煎后对垂盆草中的总黄酮溶出有促进作用，不同配比之间没有明显的规律。故笔者推测垂盆草和柴胡配伍可能是在煎煮过程中通过影响总黄酮的含量来影响药效的，而两者单独煎煮后混合并无显著影响，也就是说两者配伍不能简单地混合，必须共同煎煮才可行。中药成分复杂，不能根据某一种或几种有效成分的含量来判断药效，因此在后续的实验研究中应尽可能选取多指标成分进行研究，结合化学指标和药效学指标进行综合考察。

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DeterminationofContentofQuercetin，KaempferideandIsorhamnetininDrugPairHerbaSediSarmentosiandRadixBupleuriofDifferentProportionsbyHPLC

JIANGZhitao1，LYULingyan1，WANGTongfang1，2，CHENXiaofeng1，WUJinghua1*

(1.ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine，AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine；GraduateworkstationofenterprisesinJiangsuProvince，Zhangjiagang215600，China，2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To examine the effect of drug pair Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions on extract amount of quercetin，kaempferide and isorhamnetin.MethodsThe contents of quercetin，kaempferide and isorhamnetin in decoctions of Herba Sedi Sarmentosi，Radix Bupleuri as well as Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions were determined by HPLC，respectively.ResultsThere was no significant difference in flavonoids content of separated decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportion，and Herba Sedi Sarmentosi decoction.The total flavonoid content in together decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri increased significantly.ConclusionRadix Bupleuri enhances the extraction of total flavonoid in Herba Sedi Sarmentosi decoction.

Herba Sedi Sarmentosi；Radix Bupleuri；compatibility；total flavonoids

苏州市科技发展计划项目(SYSD2017161,SYSD2015165)

*

巫静华，主管中药师，研究方向：中药制剂及质量分析研究；Tel：(0512)56380621；E-mail：334582090@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.028

2017-02-11)