一种人参连作障碍土壤改良技术的评价研究△

李志成，闫伟，宋雯，韩京龙，张辉*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林三龙环保科技有限公司，吉林 珲春 133300)

一种人参连作障碍土壤改良技术的评价研究△

李志成1，闫伟1，宋雯1，韩京龙2，张辉1*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林三龙环保科技有限公司，吉林 珲春 133300)

目的通过性状和高效液相色谱指纹图谱对连作园参和新林地园参进行人参皂苷含量的比较，从而判断连作园参种植过程中使用的土壤改良技术是否具有抗人参连作障碍的作用。方法采用有机试剂萃取法提取连作园参和新林地园参的人参总皂苷，再通过高效液相色谱仪测定两种人参的皂苷含量，最后使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对连作园参和新林地园参样品进行比对，通过分析计算得到上述样品的相似度。结果连作园参中所含人参皂苷Rb1、Rg1、Re含量要高于新林地园参，指纹图谱显示2种园参与10种连作园参的高效液相色谱图的相似度具有一定差异性，连作园参没出现更严重的烧须、红皮现象。结论连作园参的质量要优于新林地园参，证明该土壤改良技术具有一定的抗人参连作障碍的作用。

连作园参；土壤改良技术；指纹图谱；质量

1 引言

1.1 人参

人参PanaxginsengC.A.Mey.，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智的功效[1]。人参中的人参皂苷是其主要活性成分，具有调节人的中枢神经系统、增强人体免疫系统、增强心脑血管功能、延缓衰老、抗肿瘤等作用[2]。人参中含有的人参皂苷可以分为三类：(1)原人参二醇(PPD)类，主要包括人参皂苷Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2。(2)原人参三醇(PPT)类，包括人参皂苷Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。(3)齐墩果酸(OA)类：人参皂苷R0。据辛颖[3]、Wang[4]等人的研究发现：人参皂苷Rg3可以控制癌细胞转录因子，杀死黑素瘤细胞，从而达到抑制肿瘤细胞转录、增殖的作用。杨逸[5]等人发现人参皂苷Rg1可以降低小鼠免疫性的肝损伤，确定其具有的护肝作用。Zeng[6]等人发现人参皂苷Rh2具有一定抗肿瘤的作用。同时，人参皂苷在抗衰老[7]、延缓骨骼肌萎缩[8]方面也发挥着重要的作用。

野山参在严格的生态因子下，人参皂苷含量高于林下参、园参，临床有效性强。但野生资源有限，价格高昂，已不具备批量应用价值。

1.2 连作园参和新林地园参

园参为人工毁林种植人参，除在外形上与野山参有所不同外，其有效成分也低于野山参。新林地园参在种植一茬以后，栽培地土壤理化性状劣变、化感物质累积、农残及重金属增加、养分失衡、根际微生态系统失调和土传病害增加等是导致人参连作障碍的重要因子，其中病虫害是产生连作障碍的关键因素之一。人参栽培过程中所受的病虫害种类较多，已报道的病害有40多种，种植过人参的地20年内不得重复栽参，否则会出现烧须、烂根等问题[9]。人参种植中的连作障碍是园参种植业的重要影响因素[10]。

连作园参通过微生物微生态环境、植物修复的综合技术体系改善土壤理化性质实现了土壤物理结构调整、土壤营养增加、微生物群落优化、化感物质降解的目标。

本实验中使用的连作园参是通过使用人参连作技术改良的园参与新林地园参中人参皂苷含量是否具有差异，来判断该人参连作技术是否具有一定的抗人参连作障碍的作用和质量的优势。

2 实验部分

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器

表1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

表2 实验试剂

2.1.3 实验药材 园参，四年根，产地：吉林省汪清县罗子沟镇(吉林三龙环保科技有限公司)地块1、地块2。

连作园参，四年根，产地：吉林省汪清县罗子沟镇(吉林三龙环保科技有限公司)地块3～地块12。

2.1.4 结果分析软件 中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版功能：通过导入相关液相色谱图，使用设参照谱、多点校正、自动匹配、生成对照等功能对需要的色谱图进行比对分析。可以得到这一批色谱图的相似度等信息。

2.2 实验步骤

2.2.1 连作园参和新林地园参的总皂苷提取 选取园参2种(样方地1、样方地2)，连作园参10种(样方地3～样方地12)去芦头，洗净晒干，将12种样品分别打成细粉，编号园参1号、园参2号、连作园参1号～连作园参10号。

信小娟等[11]将人参细粉用甲醇溶解后采用超声提取、索氏提取法和微波提取法进行收率的比较，最后计算得出超声提取法的收率是9.36%为最高；王中立等[12]提出用正丁醇反复萃取对分离人参中的脂类和多糖类成分结果较好；殷红梅等人[13]用氨试液萃取人参醇提取液对分离人参中的大部分多糖和鞣质效果较好。故制定方案如下：

精密称取园参1号样品粉末3 g，选择加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，弃去乙酸乙酯液；水液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用氨试液洗涤2次，每次20 mL；再用正丁醇饱和水洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，即可得园参1号供试品。

园参2号、连作园参1号～连作园参10号样品的处理方法同上。

最终得到园参1号、2号样品，连作园参1号～连作园参10号供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定1 mg的人参皂苷Rb1标准品，加1 mL甲醇溶解，得到Rb1的标准品溶液。人参皂苷标准品Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、S-PPD、S-Rg3、S-Rh2的配制方法同上。将上述11个标准品溶液均精密移取100 μL混匀后制成混合标准品溶液。

2.2.3 高效液相色谱法测定 根据占晓波等人[14]的色谱条件：Inertsil ODS-SP-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸溶液为流动相B，柱温30 ℃，检测波长为203 nm。

结合实验室条件，最终确定色谱条件为：Agilent extend C18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.5%的磷酸溶液为流动相B，按表3中的指示进行梯度洗脱；柱温30 ℃，检测波长为203 nm，流速为0.5 mL·min-1。

表3 流动相洗脱表

将2.2.1下的12个供试品溶液和混标溶液过0.45 μm滤膜后转移至液相进样瓶中，进样量为5 μL。即可得到园参1号、园参2号、连作园参1号～连作园参10号样品溶液和混标溶液的高效液相色谱图。(见图1～图3)

图1 园参的高效液相色谱图

图2 连作园参的高效液相色谱图

图3 人参皂苷混标高效液相色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分 别 注 入 HPLC中，按 照“2.2.3”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。结果以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到Rg1、Rb1、Re回归方程和线性范围，结果见表 2，各成分在各自浓度范围内线性关系良好。

成分回归方程r线性范围/μg人参皂苷Rg1y=291327x-4882 60 99990 534～35 35人参皂苷Rb1y=209401x+146910 99980 562～30 54人参皂苷Rey=208695x+509430 99990 725～43 50

2.2.5 精密度试验 分别精密吸取混合对照品溶液 10 μL，在“2.2.3”项色谱条件下重复进样 6 次，计算人参皂苷Rg1、Rb1、Re的峰面积 RSD均小于 2.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一人参供试品溶液，分别于 0、2、6、12、18、24 h进样，各色谱峰的峰面积RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性实验 精密吸取同一人参供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下重复进样6次，各色谱峰的峰面积 RSD 均小于2.0%，表明方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率实验 取已知含量的人参样品约1 g，平行6份，精密称定分别加入对照品适量，按“2.2.1”下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项色谱条件下进行分析，计算人参皂苷Rg1、Rb1、Re的平均加样回收率分别为97.24%、98.95%、99.67%。

2.2.9 样品的含量测定 按照“2.2.1”下方法制备12批供试品溶液，按“2.2.3”项色谱条件下分别测定人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量，含量测定结果见表4。

表4 12批人参样品3种皂苷类成分的含量(%)

由表4可知，连作园参中人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量要高于新林地园参。

2.3 指纹图谱的建立

本试验利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对2种园参和10种连作园参共计12个样品的高效液相色谱图进行分析比较，以探究其呈现的具有“指纹”意义的共有峰的相对保留时间、相对保留峰面积、相似度等数据。指纹图谱的建立是为了明确连作园参和新林地园参的含量差异、为连作园参的质量控制提供科学依据。在2种园参样品和10种连作园参样品的高效液相色谱图的基础上，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版的软件就可以建立上述12个样品的高效液相色谱指纹图谱，见图4。

注：S1为园参1号样品；S2为园参2号样品；S3至S12为连作园参1号样品至连作园参10号样品；R为对照谱图。图4 2种园参和10种连作园参的高效液相色谱图(检测波长：203 nm)

2.3.1 精密度实验 任意选取一个样品按照2.2.1下方法制备供试品溶液，按2.2.3下条件连续进样5次。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积值的相对标准偏差(RSD)。结果见表5、表6。

表5 方法精密度的测试(相对保留时间)

由表5可知，相对保留时间的RSD值为0.099%～0.743%。

表6 方法精密度的测试(相对峰面积)

由表6可知，相对峰面积的RSD值为0.410%～1.600%，综合二者，表明方法的精密度良好。

2.3.2 重现性实验 按照2.2.1制备同一供试品溶液5份，按2.2.3下的液相条件进样。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对保留峰面积值的相对标准偏差。结果见表7、表8。

表7 方法重现性的测试结果(相对保留时间)

由表7可知，相对保留时间的RSD值为0.070%～0.140%。

表8 方法重现性的测试结果(相对峰面积)

由表8可知，相对峰面积的RSD值为1.400%～2.100%。综合二者，说明方法重现性良好。

2.3.3 稳定性实验 取一样品按2.2.1下方法制成供试品溶液，按2.2.3下色谱条件分别于第0、4、12、24、48h进样，计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积值的相对标准偏差。结果见表9、表10。

表9 样品稳定性的测试(相对保留时间)

由9表可知，相对保留时间的RSD值为0.080%～0.220%。

表10 样品稳定性的测试(相对峰面积)

由表10可知，相对峰面积的RSD值为0.500%～2.800%。综合二者，说明样品至少在48 h内稳定。

3 小结与讨论

3.1 连作园参和新林地园参的高效液相色谱图分析

连作园参和新林地园参的高效液相色谱可分离出40余个成分。经中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件的对比，从中选取7个具有“指纹”意义和稳定的共有峰，其中包括人参皂苷Rg1、Re、Rb1，见表11。

因人参皂苷Rb1峰面积较大且稳定，故将人参皂苷Rb1色谱峰定为参照峰。计算各共有峰的相对保留时间及相对保留峰面积，见表12、表13。

表11 连作园参和新林地园参的7个共有峰

表12 园参和连作园参的7个共有峰的相对峰面积

由表12可知，7个共有峰的相对保留时间的RSD值为0.110%～0.274%。

表13 人参和连作园参的7个共有峰的相对保留时间

表13可知，7个共有峰相对保留峰面积的RSD值在0.148%～0.591%。综合二者，说明这7个共有峰均为有效峰。

3.2 指纹图谱相似度计算

指纹图谱通过比较导入到软件中的所有色谱峰的面积大小是否相似，来表述各个样品间的相似程度。相似度是一个通过研究指纹图谱来分析中药质量的稳定性的重要参考数据。指纹图谱的相似度计算是以一张指纹图谱为基础，通过高效液相色谱峰积分信息之间的比对[15]得出结果。结果表明，以共有峰的面积作为一个比较的方向，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件计算得到12种样品的高效液相色谱指纹图谱的相似度[16]，见表14。

表14 连作园参和新林地园参的指纹图谱相似度比较

从表14可以看出，2批新林地园参的相似度在0.6以上，而10批连作园参的相似度在0.9以上。

4 结论与讨论

本文将2种园参样品和10种连作园参样品的生晒参通过有机试剂萃取的方法分别提取人参总皂苷，再通过高效液相色谱仪对12批人参样品中的人参皂苷Rg1、Rb1、Re进行含量测定，结果表明连作园参中的人参皂苷含量要高于新林地园参。将得到的12个样品的色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统A版软件，就可以得到上述样品的指纹图谱。以人参皂苷Rb1为参照峰，对具有“指纹”意义的7个共有峰进行相对保留时间、相对保留峰面积和相似度的计算。结果表明，2批新林地园参的相似度在0.6以上，而10批连作园参的相似度在0.9以上，说明两者之间的成分具有一定的差异性，结合含量测定结果，连作园参的质量要优于新林地园参，连作园参没出现更严重的烧须、红皮现象。

实验证明，通过使用土壤改良技术对土地的土壤进行改良，不仅可以有效抵抗连作障碍，还可以提高人参药材质量，为人参种植产业的大规模发展起到了巨大的推动作用。

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AKindofGinsengContinuousCroppingObstacleofSoilImprovementTechnologyEvaluationResearch

LIZhichen1，YANWei1，SONGWen1，HANJinglong2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun，Changchun130117，China；2.JilinSanlongEnvironmentalProtectionTechnologyDevelopmentCo.LTD，Hunchun130117，China)

Objective：To evaluate a soil improving technology for ginseng continuous cropping obstacle through comparison of the character and HPLC fingerprint of continuous cropping garden and new woodland garden ginseng.MethodsThe total saponins were extracted，and the contents of saponins in ginseng were determined by HPLC.Finally，the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints was used to evaluate the total saponins of ginseng，and the parameters of the samples were compared with each other，and the similarity of the samples was calculated and analyzed.ResultsThe contents of ginsenoside Rb1，Rg1and Re in continuous cropping garden ginseng were higher than that in new woodland garden ginseng deforestation，and the fingerprints showed that the similarity of high performance liquid chromatograms of 10 kinds of plants was different.There is no more serious burning beard，red skin phenomenon on continuous cropping garden ginseng.ConclusionThe quality of continuous cropping ginseng is better than that of new forestland ginseng，which proves that the soil improvement technology has certain anti continuous cropping effect.

Continuous cropping garden ginseng；soil improving technology；fingerprints；quality

吉林省特色药材炮制规范项目(PZ-2016-12)

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张辉，教授;研究方向：中药化学；Tel：(0431)80812267，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.022

2017-06-26)