响应面法优化苍耳子中绿原酸的提取工艺

罗婷，周坤，叶宏俊，李鸿杰，付永莉，文婷

(华中科技大学同济医学院附属精神卫生中心，湖北 武汉 430022)

响应面法优化苍耳子中绿原酸的提取工艺

罗婷，周坤*，叶宏俊*，李鸿杰，付永莉，文婷

(华中科技大学同济医学院附属精神卫生中心，湖北 武汉 430022)

目的优化苍耳子中绿原酸的提取工艺。方法采用Box-Benhnken中心组合设计，以绿原酸得率为评价指标，对提取温度、液料比和提取时间3个影响因素进行考察，以Design-Expert 8.05软件对实验数据作统计处理。结果Box-Benhnken优化苍耳子中绿原酸最佳提取工艺条件为提取温度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取时间2 h，此工艺条件下绿原酸平均提取率可达1.94%。结论利用Box-Behnken响应面法优选的提取工艺稳定可行，对苍耳子中绿原酸提取有较好的理论指导价值。

苍耳子；响应面法；绿原酸；提取工艺；高效液相

苍耳子系菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟带总苞的果实，有散风寒、通鼻窍和祛风湿等功能[1]。其主要含多酚类、挥发油、倍半萜内酯、水溶性苷、脂肪酸等[2]多种化学成分。现代药理研究表明，苍耳子具有杀虫、抗菌、抗病毒、消炎、镇痛、抑制癌细胞增殖、增强免疫等多种药理活性[3]，而上述药理活性的发挥与其所含有的酚酸类成分绿原酸是密不可分的[4]。有研究[5]报道，炮制温度对绿原酸的含量存在较大影响，故温度为影响绿原酸含量的一大因素。目前，对苍耳子的研究主要集中于其化学成分、药理作用及临床应用方面，有关其提取工艺的研究报道相对较少[6]。为更加科学、合理和充分利用苍耳子这一中药资源，本研究以苍耳子为对象，采用高效液相色谱法测定绿原酸含量，并以其得率为响应值，结合响应面法优化苍耳子中绿原酸的提取工艺，考察提取时间、提取温度和液料比等因素之间交互作用对绿原酸提取率的影响，为苍耳子提取工艺的优化及深入开发与应用提供基础数据和理论参考。

1 仪器与试药

DIONEX-Ultimate 3000高效液相色谱仪；Starsorius BSI型电子分析天平；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省荣华仪器制造有限公司)。

苍耳子药材(湖北天济中药饮片有限公司)，经湖北中医药大学生药教研室鉴定为菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.et Widd.的成熟带总苞的果实；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-2015)；甲醇为色谱纯(美国天地公司)；其他试剂均为分析纯；水为三蒸水。

2 方法与结果

2.1 绿原酸含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.5%磷酸(A)-甲醇(B)；流速0.8 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。理论塔板数按绿原酸色谱峰计应不低于3600，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度为0.02 mg·mL-1的溶液，摇匀即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取苍耳子药材粗粉100 g，精密称定，加50%乙醇回流提取(液料比、提取时间和温度参照表4 Box-Behnken 实验方案的因素和水平)，过滤，滤液减压浓缩，回收溶剂，于烘箱中40 ℃干燥，即得苍耳子浸膏粉。取浸膏粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，摇匀、密塞称定其重量。超声处理30 min，冷却至室温再称定重量，以甲醇补足减失的量，滤过，取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.1.4 系统适用性试验 分别取上述供试品溶液、对照品溶液、空白溶剂各进样10 μL，按照2.1.1项下色谱条件进行分析，分析结果见图1～3。从图中可以看出，在该条件下绿原酸与相邻的峰基线分离度良好，其分离度大于1.5，且样品中其他组分无干扰。

图1 供试品的HPLC图谱

图2 绿原酸对照品的HPLC图谱

图3 空白溶液HPLC图谱

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取绿原酸对照品溶液2、4、8、10、12 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1.1项下色谱条件测定。以对照品进样质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=45.325 3X-0.007 4，r=0.999 9。结果表明，绿原酸在0.04～0.24 μg呈良好的线性关系。

2.1.6 方法学考察 精密度试验：精密吸取绿原酸对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，按2.1.1项下色谱条件测定，经计算得RSD为0.67%。结果表明，仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，照2.1.1项色谱条件，分别于0、3、6、9、12、24 h精密吸取10 μL，注入液相色谱仪测定，经计算得RSD为1.25%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批次苍耳子药材，按2.1.3项下供试品溶液的制备方法，依法平行制备供试品溶液6份，按2.1.1项下色谱条件进行测定。对结果进行统计，经计算得绿原酸含量的RSD为0.95%，结果表明，该方法的重复性良好。

2.1.7 加样回收试验 各取6份已知含量的苍耳子浸膏粉适量，精密称定，每份约0.5 g。向各样品中分别准确加入近等量的绿原酸对照品混匀，按2.1.1项下色谱条件进行测定。对结果进行统计，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.2 提取工艺优选

2.2.1 试验设计 在单因素考察基础上选取提取温度、液料比、提取时间和提取次数4个影响因素作为自变量，鉴于其中提取次数为非连续型变量，可不考虑回归分析，结合工业生产实际情况及文献[7]，拟设定为2次。根据Box-Behnken设计原理，取提取温度、液料比、提取时间每个因素下各设定3个水平，依次用代码值-1、0、+1表示。Box-Behnken设计中心组合设计因素水平见表3，以苍耳子提取物中绿原酸的得率为评价指标，Box-Behnken 试验方案与结果见表4。

2.2.2 模型拟合与方差分析 运用 Design-Expert软件对表4中的数据作回归分析，得液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)与绿原酸得率(Y)之间的线性回归拟合方程：Y=-19.195+1.137 5A+0.405 0B+0.46C+0.012 5AB+0.03AC-0.05BC-0.17A2-0.002 85B2-0.06C2(决定系数R2=0.988 1)。方差分析结果表明，拟合得到的回归方程P<0.01，说明该模型在本研究所选定的因素范围内有统计学意义。A、B、AB、A2、B25个因素对绿原酸得率的线性效应有极显著影响(P<0.01)；因素C2对绿原酸得率的线性效应有显著影响(P<0.05)；因素A、B交互作用对绿原酸得率的线性效应有极显著影响(P<0.05)，响应面模型方差分析结果见表5。

表3 Box-Behnken设计中心组合设计因素水平

表4 Box-Behnken试验方案与结果

表5 响应面模型方差分析结果

注：P<0.01 为极显著；P<0.05为显著。

本模型拟合极显著(P<0.01)、失拟项P值(0.872 1)大于0.05说明，实验误差小且实测值与预测值之间不存在失拟，因而该数学模型具有较好的预测性，故可以采用该模型对其作响应面分析。Design-Expert软件绘制液料比、提取温度和提取时间因素对于响应值的三维曲面见图4～6、响应值的等高线见图7～9。

图4 液料比、提取时间交互作用对于响应值的三维曲面图

图5 液料比、提取温度交互作用对于响应值的三维曲面图

图6 提取温度、提取时间交互作用对于响应值的三维曲面图

图7 液料比、提取时间交互作用对于响应值的等高线图

图8 提取温度、提取时间交互作用对于响应值的等高线图

图9 液料比、提取温度交互作用对于响应值的等高线图

比较3组曲面响应图可知，液料比(A)与提取温度(B)的响应曲面图呈现较陡峭的曲面，故此二者的交互作用对绿原酸提取率的影响最为显著。其他两个交互作用对绿原酸提取率的影响较小；响应曲面均为开口向下的凸面，等高线为椭圆形，响应值中心位于考察区域范围内，可知在所考察的范围内存在绿原酸得率最大值；响应面为高度卷曲的曲面，说明响应因素与相应值之间的关系不是简单的一次线性方程所能解释的。由Design-Expert软件统计分析数据，给出苍耳子中提取绿原酸的参考工艺：液料比为8.6倍、提取温度为88.68 ℃、提取时间为2 h，理论计算最优绿原酸得率可达1.942%。为方便提取实际操作，将此工艺条件进一步调整：液料比9倍、提取温度为89 ℃、提取时间为2 h进行验证试验。

2.2.3 验证试验 准确称取苍耳子细粉3份，每份100 g，按优选的工艺条件进行绿原酸提取，结果见表6。

表6 验证试验结果 %

试验结果与回归方程的预测值较接近，验证了该数学模型的准确性，故采用其优化苍耳子中绿原酸提取工艺是有指导意义的。

3 讨论

目前，绿原酸的提取工艺研究中多采用正交设计，正交试验是对孤立的实验点进行分析的一种优化多变量系统的有效试验设计工具，能给出最佳因素水平组合，却无法找出整个区域上因素最佳组合和响应值的最优值[8]。而响应面法则通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，将多因素试验中因素与指标的相互关系用二次多项式拟合的一种统计方法；研究因素与响应值之间、因素之间的交互作用，获得的预测模型多为曲面，在实验条件寻优过程中，可以连续地对实验各水平进行分析[9]；能快速、有效地从影响绿原酸得率因素中筛选出最显著的因素，避免次要因素带来的资源和时间浪费，同时以较少实验次数和较短时间对所选的实验参数进行全面考察[10]。

本研究采用效应面法优化苍耳子提取工艺，对液料比、提取温度和提取时间等因素及其交互作用进行考察。结果发现，液料比、提取温度对苍耳子中绿原酸的提取有极显著性影响；影响次序为液料比>提取温度>提取时间，而提取时间对绿原酸得率的影响不显著(p<0.001)；液料比和提取温度的交互作用对绿原酸得率有显著影响。在规模化提取过程中从溶剂消耗、生产效率和降低成本等角度考虑，提取次数定为2次完全满足生产需要，充分结合本研究所优化的工艺参数，确定苍耳子最优工艺条件为提取温度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取时间2 h、提取2次，为苍耳子中绿原酸提取提供了参考和依据。

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ExtractionofChlorogenicacidinFructusXanthiibyResponseSurfaceMethod

LUOTing，ZHOUKun*，YEHongjun*，LIHongjie，FUYongli，WENTing

(AffiliatedMentalHealthCenter,tongjiMedicialofHuazhonguniversityofscience&Technology，HubeiWuhan，430022，China)

Objective：To optimize extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii.MethodsWith the content of chlorogenic acid yield in Fructus Xanthii as an index，the effect of three factors，i.e.extraction temperature，solvent-solid ratio and extraction time was designed by Box-Behnken central composite.Design-Expert 8.05 software was used for the statistical processing of the experimental data.ResultsThe optimizing extraction conditions of Fructus Xanthii were as follows：ethanol concentration was 50%，extracting time was two hours extracting temperature was 79 ℃ and solvent-solid ratio was 9.Under the conditions，the average chlorogenic acid yield was 1.94%.ConclusionThe optimized extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii by application of response surface methodology is stable and feasible and the result can provide theoretical guidance for large-scale extraction chlorogenic acid in Fructus Xanthii.

Fructus Xanthii；response surface methodology；chlorogenic acid；extraction；HPLC

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周坤，药师，研究方向：制剂研究，E-mail：822733781@qq.com；叶宏俊，药师，研究方向：制剂研究，E-mail：822733781@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.025

2017-01-18)