福林-酚比色法测定葡萄烈酒中总多酚含量的研究

张 娅，石方剑，杨有仙*

（1.红河州质量技术监督综合检测中心，云南 蒙自 661199；2.红河学院理学院，云南 蒙自 661199）

福林-酚比色法测定葡萄烈酒中总多酚含量的研究

张 娅1，石方剑2，杨有仙1*

（1.红河州质量技术监督综合检测中心，云南 蒙自 661199；2.红河学院理学院，云南 蒙自 661199）

该试验对福林-酚比色法测定葡萄烈酒中总多酚含量的最佳条件进行了研究。结果表明，最佳检测条件确定为反应温度40℃、显色时间20 min、检测波长736 nm。在此最佳条件下，没食子酸质量浓度在50～400 μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好（相关系数R2=0.997 4），方法重复性试验和精密度试验结果相对标准偏差（RSD）分别为1.97%和1.17%，回收率为98.61%～103.22%，RSD值为2.34%，表明该方法重复性好、精密度和准确度较高，可用于葡萄烈酒中总多酚含量的检测。

福林-酚比色法；葡萄烈酒；总多酚；检测条件

葡萄烈酒是高浓度烈性酒，酒精度在45%vol～85%vol范围内，主要产于云南省红河州弥勒市，一般采用水晶葡萄作为原料，以白兰地酿酒技术为基础，结合中国传统的酿酒特点，经特殊工艺加工而成。葡萄烈酒与白兰地、威士忌、朗姆酒、杜松子酒等烈酒相比，有其独特的酒体和香气。新蒸馏的原葡萄烈酒质地粗糙、香味不圆熟，不具有葡萄烈酒的口味和香气，需经橡木桶多年贮存陈酿才逐渐完成向陈酿葡萄烈酒的转变[1]。在陈酿的过程中，原葡萄烈酒发生一定程度的氧化，并从橡木桶中萃取出酚类、单宁、半纤维素等物质[2-3]，这些物质增加了葡萄烈酒的口感，构成了葡萄烈酒的独特风格，对葡萄烈酒的等级具有重要的影响。葡萄烈酒中总多酚含量一定程度上反映了葡萄烈酒陈酿的时间及后熟程度，所以葡萄烈酒中总多酚含量的测定有助于衡量葡萄烈酒的质量和品质。

国内对多酚类化合物的测定方法主要有：高锰酸钾滴定法[4-5]、分光光度法（酒石酸亚铁法[4]、福林-酚（Folin-ciocalteu）法[6-8]和铁氰化钾分光光度法[9-10]）、液相色谱法[11-12]等。福林-酚法具有显色明显、误差小、回收率高的特点[13]，因此本研究在前人的基础上尝试用福林-酚法对葡萄烈酒中总多酚物质含量进行测定。

没食子酸常用来作为多酚含量测定的标准物质[14-16]，研究显示，没食子酸标液质量浓度在200～600 mg/L下，用福林-酚法测定，线性良好，并发现反应时间和反应温度是导致实验结果不稳定（重现性差）、误差大（回收率低）的两个重要原因[13]；有文献指出[6]，反应温度为70℃，反应时间为30min时，实验结果稳定。李巨秀等[17]采用福林-酚比色法对桑椹中总多酚含量的研究结果表明，反应温度为40℃，反应时间为50 min时，结果重现性好、加标回收率高。可见反应温度、时间对多酚含量检测结果的影响较大。因此本试验研究了福林-酚法测定葡萄烈酒中总多酚物质含量时，检测波长、反应时间、反应温度对多酚含量的影响，并考察了方法的可靠性和准确度，以期建立一个快速准确地测定葡萄烈酒中总多酚含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄烈酒（酒精度80%vol）：云南省红河州弥勒市市售；葡萄烈酒A（酒精度82%vol于不锈钢罐储存陈酿）、葡萄烈酒B（酒精度81%vol于橡木桶储存陈酿）、葡萄烈酒C（酒精度72%vol于土罐储存陈酿）：云南省红河州弥勒东风宝云酒庄；福林-酚试剂（分析纯）：美国Sigma公司；没食子酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na2CO3（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；其他试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

MS205DU电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-2550双光束紫外可见分光光度计：日本岛津公司；HH-4数显电子恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；Transfer pette移液器：普兰德（上海）贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波长的选择

多酚类化合物在碱性条件下，与福林-酚试剂形成蓝色物质。取25 mL具塞比色管一支，加入0.5 mL质量浓度为150 μg/mL的没食子酸标准溶液、1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液[7]，用去离子水定容，常温条件下反应1.5 h后用双光束紫外可见分光光度计对反应后试液进行700～780 nm范围全波长扫描，获取最大吸收波长。

1.3.2 最佳反应时间的选择

取8支25 mL具塞比色管，编号为1～8号，1～7号比色管中各加入0.5 mL质量浓度为150 μg/mL的没食子酸标准溶液，8号管中加入0.5 mL去离子水，各管中再加入1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30s后向各管加入18mL4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，将1～7号比色管于40℃水浴锅中分别反应5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min时，以8号管（40℃反应20 min）作参比液，在波长736 nm处测定各比色管中试液的吸光度值。以反应时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制吸光度值-反应时间曲线，确定最适宜的反应时间。

1.3.3 最佳反应温度的选择

取8支25 mL具塞比色管，编号为1～8号，1～7号比色管中各加入0.5 mL质量浓度为150 μg/mL的没食子酸标准溶液，8号管中加入0.5mL去离子水，分别向各管中加入1mL福林-酚显色剂（每个比色管添加时间间隔1 min），混匀静置30s后加入18 mL4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，1～7号比色管分别于15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃反应20 min后，在波长736 nm处测定吸光度值，以8号管（40℃反应20min）作为参比以反应温度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制吸光度值-温度曲线，确定最适宜的反应温度。

1.3.4 标准曲线的绘制

准确称取1.000g没食子酸，用去离子水定容至100mL，配制成质量浓度为10 mg/mL没食子酸标准溶液，依次稀释成50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400 μg/mL没食子酸标准工作液，分别取0.5 mL没食子酸标准工作液于25 mL比色管中，加入1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，40℃水浴反应20 min后，以8号管（40℃反应20 min）作为参比，于波长736 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线。

1.3.5 数据处理

所有试验数据应用Excel软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

没食子酸标准溶液与福林-酚试剂反应后于700～780nm范围进行全波长扫描，结果见图1。由图1可知，反应液在波长736nm处有最高吸收峰，因此选择736 nm作为福林-酚法测定葡萄烈酒中总多酚的最佳波长。

图1 反应液在可见光区的吸收曲线Fig.1 The absorption curve of reaction liquid in the visible region

2.2 反应时间对吸光度值的影响

考察反应时间对反应液吸光度值的影响，绘制吸光度值-反应时间变化曲线，结果见图2。

图2 反应时间对反应液吸光度值的影响Fig.2 Effect of reaction time on the absorbance value of the reaction liquid

由图2可知，随反应时间的延长，反应液吸光度值先迅速增加，当反应时间为20 min时，吸光度值达到最大值，说明此时反应液中有色物质含量最高；继续延长反应时间，吸光度值开始下降，表明反应液中有色物质开始分解，40min后酒样的吸光度值趋于稳定。因此，选择20 min为最佳反应时间。

2.3 反应温度对吸光度值的影响

考察反应时间对反应液吸光度值的影响，绘制吸光度值-反应时间变化曲线，结果见图3。

图3 反应温度对反应液吸光度值的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the absorbance value of the reaction liquid

由图3可知，随着反应温度的升高，反应液吸光度值呈先增加后减小的趋势，当反应温度为40℃时，吸光度值达到最高；继续升高反应温度，吸光度值开始下降，可能是由于随着反应温度升高有色物质逐渐被分解。因此，选择40℃为最适宜的反应温度。

2.4 没食子酸标准曲线的绘制

以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，结果见图4。

图4 没食子酸标准曲线Fig.4 Standard curve of gallic acid

由图4可知，没食子酸标准曲线回归方程为：y=0.0036x+0.096 2，相关系数R2=0.997 4，表明没食子酸在质量浓度50～400 μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

2.5 重复性和精密度试验

准确吸取1 mL葡萄烈酒样品6份于6支25 mL的具塞比色管中，加入1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，40℃水浴反应20min后，以8号管中试液作为参比，于波长736nm处测定吸光度值，由标准曲线计算葡萄烈酒样品中总多酚含量，计算相对标准偏差（relative standarddeviation，RSD），考察方法重复性，同一管中的试液连续测定6次，计算相对标准偏差（RSD），考察方法的精密度。结果表明，在选定的最佳反应条件下，重复性试验结果的RSD值为1.97%，精密度试验结果RSD值为1.17%，表明该方法具有良好的重复性和精密度。

2.6 回收率试验

准确吸取1mL的葡萄烈酒样品9份于9支25 mL具塞比色管中，分成3个浓度组，每组3个平行，分别加入50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的没食子酸标准溶液，然后加入1mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后，加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，40℃水浴反应20 min后，以8号管作为参比，于波长737 nm处测定吸光度值，加标回收率计算结果见表1。

表1 加标回收率试验结果Table 1 Results of adding standard recovery tests

由表1可知，葡萄烈酒中总多酚平均加标回收率在98.61%～103.22%，相对标准偏差（RSD）为2.34%，表明该方法准确度较高，可用于葡萄烈酒中总多酚含量的检测。

2.7 葡萄烈酒样品中总多酚含量的测定

采用上述所建立的方法对3种不同储存条件下葡萄烈酒样品中的总多酚含量进行测定，结果见表2。

表2 不同储存条件下葡萄烈酒中总多酚含量测定结果Table 2 Determination results of total polyphenols content in grape spirits under different storage conditions

由表2可知，A、B、C三种存储陈酿方式的葡萄烈酒中总多酚含量分别为32.72 μg/mL、111.89 μg/mL、47.35 μg/mL，其中于橡木桶储存陈酿的葡萄烈酒中总多酚含量明显高于其他二种。这是由于橡木桶储存陈酿的葡萄烈酒中总多酚除了来源于葡萄浆果之外，还来源于橡木桶的多酚类物质。在葡萄烈酒储存陈酿过程中，原葡萄烈酒发生一定程度的氧化，从橡木桶中萃取出单宁等多酚类物质，橡木桶中多酚可以增加葡萄烈酒中总酚的含量，并与其他酚类物质共同来增加或修饰葡萄烈酒的香气、口感和色泽[2-3]。

3 结论

本试验对福林-酚法测定葡萄烈酒中总多酚含量的检测条件：波长、反应时间、反应温度进行了研究，并考察了方法的重复性、精密度和回收率。结果显示，福林-酚法测定葡萄烈酒中总多酚含量的最佳条件为：反应温度40℃、显色时间20 min、检测波长736 nm。在该条件下没食子酸质量浓度在50～400 μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好（R2=0.997 4），方法重复性试验和精密度试验结果相对标准偏差（RSD）分别为1.97%和1.17%，平均加标回收率为98.61%～103.22%，RSD值为2.34%，表明该方法重复性好、精密度和准确度较高，可作为福林-酚法测定葡萄烈酒中总多酚含量的参考条件。

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Determination of the total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteu colorimetry method

ZHANG Ya1,SHI Fangjian2，YANG Youxian1*
(1.Honghe Quality and Technical Supervision Comprehensive Testing Center,Mengzi 661199,China;2.College of Science,Honghe University,Mengzi 661199,China)

The optimum determination conditions of total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteaut method were researched.The results showed that the optimum determination conditions were be identified as reaction temperature 40℃,developing time 20 min and detection wavelength 736 nm.Under the optimum conditions,the gallic acid in the range of 50-400 μg/ml had a good linear relationship with the absorbance value(R2=0.997 4).The relative standard deviation(RSD)of method repeatability test and the precision tests results were 1.97%and 1.17%,respectively.The recovery rate was 98.61%-103.22%,RSD was 2.34%,which indicated the method had good repeatability,precision and high accuracy,and could be used for the determination of total polyphenols content in grape spirits.

Folin-ciocalteu colorimetry;grape spirits;polyphenols;detection conditions

TS207.3

0254-5071（2017）10-0163-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.034

2017-05-24

张 娅（1962-），女，高级工程师，本科，研究方向为食品安全与检测。

*通讯作者：杨有仙（1987-），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品安全与检测。